5. Điểm mới
2.2.2. Phương pháp toán học
Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp sau: + Số trung bình cộng: dùng để tính các giá trị trung bình của các lần lặp
lại thí nghiệm. X = n i i X n 1 1
+ Trung bình bình phương các sai lệch: δ =
2 1 ( ) 1 n i i X M n
+ Sai số đại diện của trung bình cộng: ±m =
n
+ Hệ số biến thiên trung bình cộng: Cv = 100
M
Trong đó : M là trung bình cộng các chỉ số acid tạo thành n là số lần thí nghiệm
m là sai số đại diện của trung bình cộng lượng acid tạo thành X là chỉ số acid tạo thành trong các lần thí nghiệm
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát sự tạo màng của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum
BHN2 và CH14
Màng BC được hình thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy khi lên men acetic với sự tham gia của vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14, màng cần đáp ứng được các yêu cầu tiêu chuẩn sau: màng mỏng 2-3 mm, dai, bề mặt trơn, màu sáng, mùi dễ chịu.
Dựa vào môi trường cơ bản, chúng tôi thay đổi thành phần cacbon, nitơ và các yếu tố kích thích sinh trưởng để thiết lập môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14, theo dõi khả năng tạo màng, theo dõi khối lượng thô của màng nhằm tìm môi trường lên men thích hợp.
Bảng 3.1. Khả năng tạo màng BC trên các loại môi trƣờng khác nhau của chủng vi khuẩn A.xylinum
Đặc điểm MT3 MT4 MT5 MT6
Thời gian tạo màng 6 4 6 5
Tính chất của màng Khá dai Dai Dai Dai
Màu sắc của màng Màu sáng Vàng ngà Vàng đậm Trắng trong
Khối lượng của màng 3,45 3,52 3,59 3,65
Trong các môi trường có thành phần khác nhau, khả năng tạo màng của chủng A.xylinum cũng khác nhau: MT4 và MT5 là các môi trường có bổ sung pepton thì màng tạo thành có khả năng đàn hồi tốt tuy nhiên khối lượng màng BC thu được ở hai môi trường lại không đồng nhất, có màu vàng nên khi xử lý tốn rất nhiều thời gian và kinh phí. MT3 không được bổ sung pepton
hồi tốt, mùi thơm dịu và cho màng BC dày và khối lượng lớn nhất. MT6 là môi trường nước dừa già nguyên chất có chứa đường glucose và đường fructose tạo điều kiện thích hợp cho quá trình tổng hợp màng BC. Dựa vào mục đích nghiên cứu chúng tôi quyết định chọn MT6 là môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng, vitamin… cho màng BC đạt chỉ tiêu cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn
Acetobacterxylinum BHN2 và CH14
3.2.1 . Xác định hàm lượng acid acetic tạo thành của các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 Acetobacter xylinum BHN2 và CH14
Chúng tôi tiến hành kiểm tra hàm lượng acid acetic tạo thành nhằm xác định khả năng lên men và khả năng chịu đựng trong môi trường acid của các chủng. Trước hết nuôi cấy các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum đã tuyển
chọn được. Sau khi nuôi cấy 10 ngày, tiến hành chuẩn độ acid acetic tạo thành bằng NaOH 0,1N. Kết quả như sau:
Bảng 3.2. Khảo sát khả năng tạo thành acid acetic của các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum
STT Mẫu vi khuẩn M m (%) δ (%) Cv (%)
1 BHN2 1,17 0,020 0,040 3,419
2 CH14 1,11 0,035 0,060 5,000
Qua bảng ta thấy rằng các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum đều có tạo thành acid acetic trong quá trình nuôi cấy. Hàm lượng acid acetic tạo thành đạt từ 1,0 – 1,2 %. Chính vì vậy vi khuẩn Acetobacter xylinum được sử dụng trong sản xuất giấm ăn (lên men giấm). Thực chất của quá trình này là sự oxy hóa rượu etylic không hoàn toàn tạo thành acid acetic trong môi trường sau:
3.2.2. Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum trên kính hiển vi quang học hiển vi quang học
3.2.2.1. Hình thái và tế bào học chủng vi khuẩn A.xylinum
Để quan sát hình dạng tế bào các vi khuẩn Acetobacter xylinum chúng tôi tiến hành làm tiêu bản và nhuộm Gram. Lấy mẫu váng hoặc dịch nuôi cấy hoặc vi khuẩn cấy trong ống thạch nghiêng làm tiêu bản và nhuộm Gram. Đưa lên kính hiển vi quang học để quan sát thấy rằng vi khuẩn A.xylinum là
những trực khuẩn Gram âm có dạng hình que đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi, không di động, bắt màu hồng fuchsin. Khi quan sát trên kính hiển vi điện tử thấy rõ các tế bào vi khuẩn dài có kích thước khoảng 2µm được bao bọc bởi chất nhầy tạo thành váng dầy bắt màu hồng (khi nhuộm bằng thuốc nhuộm iot và H2SO4 váng này bắt màu xanh). Trên kính hiển vi điện tử còn có thể quan sát thấy sự bắt màu đậm nhạt khác nhau của các phần khác nhau bên trong tế bào vi khuẩn.
Hình 3.1. Chủng giống vi khuẩn A.xylinum
Hình 3.2. Tế bào vi khuẩn A.xylinum
Kích thước tế bào 0,6 – 0,8 µm, có tiêm mao và có khả năng di động, sống hiếu khí bắt buộc, hóa dưỡng hữu cơ, không bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày.
3.2.2.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa
Trên môi trường thạch đĩa vi khuẩn A.xylium hình thành khuẩn lạc
Hình 3.3. Khuẩn lạc A.xylinum trên môi trƣờng thạch đĩa
Quan sát thấy khuẩn lạc có một số các đặc điểm sau:
Một số khuẩn lạc có hình tròn, phẳng, có bề mặt mịn, trơn, nhẵn
Một số có hình cầu, bóng như giọt mỡ với phần trung tâm dày, rắn, sẫm màu, phần xung quanh sáng hơn gần như không có màu
Một số khác có kích thước lớn hơn, bề mặt xù xì, khô, mép khuẩn lạc nhăn.
3.2.2.3. Hoạt tính catalase
Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc ta thấy có hiện tượng sủi bọt khí. Chứng tỏ oxy được giải phóng ra, hay nói cách khác dưới tác dụng của enzyme catalase phân giải H2O2 theo phương trình:
H2O2 catalase H2O + 1/2 O2
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của chủng A.xylinum
3.2.2.4. Khả năng sinh acid acetic của vi khuẩn A.xylinum với chất chỉ thị màu Blue bromphenol
Chất chỉ thị màu Blue bromphenol 0,04% vi khuẩn A.xylinum có khả năng chuyển hóa rượu etylic thành acid acetic làm môi trường chuyển từ màu xanh lục sang màu vàng.
Có thể giải thích như sau: Blue bromphenol là một chất chỉ thị màu cơ bản, bản thân phân tử có màu vàng, ion có màu lam. Khi dung dịch có pH:4,23 thì tỷ số giữa màu vàng và màu lam là 1, lúc đó nồng độ của chúng là như nhau, dung dịch có màu lục. Khi sử dụng môi trường nuôi cấy có pH> 4,6 thì số ion lam tăng, không nhìn thấy các phân tử màu vàng, dung dịch có màu lam.
Hình 3.5. Chuyển hóa rƣợu etylic thành acid acetic của vi khuẩn
A.xylinum
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum
BHN2 và CH14
3.3.1. Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14
Chúng tôi xác định quá trình sinh trưởng của 2 chủng này trên môi trường nhân giống số 6. Môi trường được khử trùng ở 0,5atm, thời gian để nguội là 30 phút. Sau khi khử trùng bổ sung thêm acid acetic và rượu etylic. Sau đó xác định số lượng tế bào ở các thời điểm 0h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h. Qua đó áp dụng phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu chúng tôi đã thu được kết quả ở bảng:
Bảng 3.3. Xác định số lƣợng tế bào của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 Mẫu Giờ A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14 Mm δ Mm δ 0 8,00,03 0,02 100,20 0,04 24 17 0,53 0,05 23,00,15 0,03 48 51 1,50 1,32 53,00,33 0,57 72 83,0 1,70 2,15 78,50,00 0,00 96 97,04,0 1,56 90,03,07 1,15 120 103,05,00 6,30 95,02,50 4,70 144 90,04,70 3,30 80,03,42 5,70 168 703,30 5,12 72,03,34 6,50
Qua bảng chúng tôi dựa vào số liệu để xây dựng đồ thị 1 biểu diễn quá trình sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14
0 20 40 60 80 100 120 0 24 48 72 96 120 144 168 A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14
Hình 3.6 . Đồ thị biểu diễn quá trình sinh trƣởng của 2 chủng vi khuẩn
A.xylinum BHN2 và CH14
Nhận xét: Nhìn vào đồ thị 1 ta thấy rõ sự phát triển của 2 mẫu vi khuẩn
Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 theo một đường cong và có điểm cực đại ở 120h.
Tiếp tục nghiên cứu động thái phát triển của 2 mẫu trên chúng tôi tiến hành chuẩn độ dễ xác định hàm lượng acid acetic tạo thành qua các thời điểm đã định. Kết quả nghiên cứu được xử lý và trình bày ở bảng.
Bảng 3.4. Sự biến thiên hàm lƣợng acid acetic của 2 mẫu vi khuẩn
Acetobacterxylinum qua thời gian nuôi cấy khác nhau
Ký hiệu Lƣợng acid acetic tạo thành
0 24 48 72 96 120 144 168
BHN2 0,2 0,3 0,7 1,3 1,7 1,9 1,5 1,0
CH14 0,3 0,5 0,9 1,4 1,8 2,0 1,7 1,1
Dựa vào bảng chúng tôi xây dựng được đồ thị biểu diễn sự tạo thành lượng acid acetic của các mẫu qua các thời gian nghiên cứu khác.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 24 48 72 96 120 144 168 A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự tạo thành acid acetic trong dịch lên men của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14.
Qua nghiên cứu theo dõi quá trình phát triển của 2 chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 chúng tôi phân chia quá trình phát triển của vi khuẩn Acetobacter xylinum thành 4 thời kỳ phát triển kế tiếp nhau gồm 4 pha: pha tiềm phát, pha cấp số mũ, pha cân bằng, pha suy vong.
Từ 0-48h là pha tiềm phát: Trong pha này lượng acid acetic tăng chậm do vi khuẩn Acetobacter xylinum phải làm quen với môi trường tăng sinh khối tế bào
Từ 48-96h là pha cấp số mũ: Vi khuẩn Acetobacter xylinum phát triển
mạnh. Ở cuối pha lượng acid acetic tăng nhanh
Từ 96-120h là pha cân bằng: ở giai đoạn này số lượng tế bào tăng chậm và có thể không tăng do thiếu oxy hay bị nhiễm độc. Ở cuối pha lượng acid acetic đạt giá trị cực đại
Từ 125h trở đi là pha suy vong : Số lượng tế bào giảm do acid acetic ức chế ngược lại hoặc do môi trường thiếu chất dinh dưỡng
3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tạo màng của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14
Để kiểm tra ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tạo màng ở 2 chủng Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 tôi sử dụng môi trường tiêu chuẩn có sự thay đổi nguồn cacbon (MT1, MT2, MT3, MT4, MT5).
Nguồn Cacbon sử dụng: Fructose, Sorbitol, Sacarose, Glucose, Ethanol Sau 120h thu màng, kiểm tra độ ảnh hưởng của cacbon tới độ dày màng . Kết quả thí nghiệm dẫn ra ở bảng sau:
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới độ dày màng BC (mm) Nguồn cacbon (mm) A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14 M δ ± m Cv M δ ± m Cv Fructose 1,40 0,015 0,087 1,07 1,20 0,05 0,003 0,4 Sorbitol 1,37 0,173 1,100 12,65 0,87 0,023 0,013 2,7 Sacarose 1,00 0,040 0,023 2,50 0,47 0,063 0,036 4,3 Glucose 2,50 0,010 0,006 2,00 2,47 0,023 0,013 4,9 Ethanol 1,53 2,735 1,580 77,50 1,43 0,363 0,209 8,2
Trong đó: M là giá trị trung bình tổng thể
± m là sai số đại diện của trung bình cộng δ là trung bình bình phương các sai biệt Cv là hệ số biến thiên trung bình (+) Số lần thí nghiệm: 3 lần (n=3)
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khối lƣợng tƣơi của màng (g/40ml) Nguồn cacbon (g/40ml) A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14 n M δ ± m Cv n M δ ± m Cv Fructose 5 3,66 0,13 0,06 3,55 5 3,16 0,67 0,30 21,20 Sorbitol 5 3,45 0,87 0,39 24,58 5 2,96 0,58 0,26 19,59 Sacarose 5 3,55 0,19 0,09 5,35 5 2,34 0,30 0,13 10,56 Glucose 5 4,92 0,08 0,36 2,74 5 3,79 0,81 0,36 45,52 Ethanol 5 3,90 1,13 0,59 19,15 5 3,30 1,06 0,48 14,52
Trong đó: M là giá trị trung bình tổng thể
± m là sai số đại diện của trung bình cộng δ là trung bình bình phương các sai biệt Cv là hệ số biến thiên trung bình (+) n là số lần thí nghiệm
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khối lƣợng khô của màng (g/40ml) Nguồn cacbon (g/40ml) A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14 n M δ ± m Cv n M δ ± m Cv Fructose 3 0,38 0,07 0,04 18,42 3 0,58 0,12 0,07 20,69 Sorbitol 3 0,56 0,13 0,08 23,21 3 0,46 0,42 0,24 91,30 Sacarose 3 0,18 0,02 0,01 11,11 3 0,28 0,09 0,05 32,14 Glucose 3 1,78 0,03 0,02 37,50 3 2,11 0,02 0,01 18,18 Ethanol 3 0,31 0,78 0,45 77,23 3 1,37 0,31 0,18 22,63
Trong đó: M là giá trị trung bình tổng thể
± m là sai số đại diện của trung bình cộng δ là trung bình bình phương các sai biệt Cv là hệ số biến thiên trung bình (+) Số lần thí nghiệm: 3 lần (n=3)
Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng trên cho thấy chủng vi khuẩn
A.xylinum BHN2, CH14 có khả năng tạo màng tốt nhất ở nguồn cacbon là glucose và kém nhất là saccarose.
Nguồn cacbon là glucose cho màng tốt nhất vì: glucose là một loại đường đơn giản (monosaccarit) nên vi khuẩn dễ hấp thụ và liên kết được với glucose để tạo thành lớp màng BC đồng nhất. Còn các loại đường khác như saccarose là một loại đường disaccarit nên chúng cần có thời gian chuyển hóa thành glucose, đồng thời khi saccarose thủy phân thành gốc α-glucozơ và gốc β-fructozơ, đều là những loại đường đơn nên vi khuẩn rất dễ hấp thụ nhưng tùy thuộc vào từng chủng vi khuẩn mà chúng sẽ sử dụng loại đường nào là phù hợp với mình hơn.
cellulose vi khuẩn được hình thành trực tiếp từ các đơn phân là glucose. Các loại đường khác thì phải trải qua giai đoạn chuyển hóa thành glucose thì mới bắt đầu giai đoạn hình thành cellulose [10], [11], [12].
Vậy với nguồn cacbon là glucose thích hợp cho các chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 lên men tạo màng
3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ tới khả năng tạo màng của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14
Để kiểm tra ảnh hưởng của nitơ tới khả năng tạo màng BC ở 2 chủng
A.xylinum BHN2 và CH14 chúng tôi sử dụng môi trường tiêu chuẩn có sự thay
đổi nguồn nitơ.
Nguồn nitơ sử dụng là:
+ Nguồn nitơ hữu cơ : pepton, cao nấm men + Nguồn nitơ vô cơ : (NH4)2SO4 và KNO3
Sau 168h thu màng, kiểm tra ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới độ dày màng . Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nitơ tới độ dày của màng BC (mm)
Nguồn Nitơ (mm) A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14 n1 n2 n3 nTB n1 n2 n3 nTB Pepton 2,0 1,7 2,0 1,9 2,0 1,8 1,9 1,9 (NH4)2SO4 1,0 1,0 0,9 0,97 0,7 1,0 0,9 0,87 KNO3 0,8 0,7 0,7 0,73 0,6 0,7 0,6 0,63 Cao nấm men 2,2 2,0 2,5 2,33 2,4 2,3 2,3 2,33
n1, n2, n3: Độ dày trung bình của lần thí nghiệm 1,2,3 nTB: Độ dày trung bình của màng ở 3 lần thí nghiệm.
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nitơ tới khối lƣợng màng (g/40ml) Nguồn Nitơ (g/40ml) A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14 X1 X2 X3 XTB X1 X2 X3 XTB Pepton 3,20 2,22 2,86 2,36 2,64 2,14 3,34 2,38 (NH4)2SO4 1,74 1,60 1,35 1,56 1,52 1,80 1,92 1,75 KNO3 1,02 1,80 1,38 1,40 1,28 1,35 1,26 1,30 Cao nấm men 3,55 2,50 3,20 3,02 2,84 2,46 3,64 2,98
X1, X2, X3: Khối lượng màng của lần thí nghiệm 1,2,3 XTB: Khối lượng màng ở 3 lần thí nghiệm
Nguồn nitơ ảnh hưởng gián tiếp tới khả năng tạo màng BC thông qua quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn A.xylinum. Nitơ có mặt trong nhiều thành phần cấu tạo của axit nucleic, photpholipit, có các coenzyme quan trọng như ATP, NADP, FDA, 1 số vitamin tham gia vào quá trình tạo thành hemicelluloses.
Ở bảng ta thấy 2 chủng đều sinh trưởng tốt trong môi trường nitơ hữu cơ và yếu hơn trong môi trường nitơ vô cơ.
3.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của pepton tới khả năng tạo màng của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14