5. Điểm mới
2.1.4.3. Môi trường lên men
Bảng 2.1. Thành phần các môi trƣờng lên men
TT Thành phần MT 1 MT 2 MT3 MT4 MT5 MT6 1 Glucose 20 g 20g 20g 20g 20g 20g 2 Agar 20g 3 (NH4)2SO4 3g 3g 3g 3g 5g 3g 4 KH2PO4 2g 2g 2g 2g 2g 2 5 MgSO4.7H2O 2g 2g 2g 2g 2g 6 Acid acetic 2% 2% 2% 2% 2% 2% 7 Pepton 5g 3g 5g 8 Nước mía ép 200ml 9 Nước dừa 1000ml 10 Nước máy 1000ml 1000ml 1000ml 800ml 1000ml
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc
Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa. Nuôi ở 30oC trong 5 ngày đếm khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức [14].
1000 1 . . 10 i n i N A V
Trong đó: N là tổng số CFU trong 1ml mẫu ban đầu. Ai là số khuẩn lạc trung bình tạo vòng phân giải CaCO3 trên đĩa phân lập có độ pha loãng 10-n. Vi là thể tích dịch mẫu trên mỗi đĩa phân lập. 10-n là là độ pha loãng của mẫu phân lập.
2.2.1.2. Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum bằng phương pháp nhuộm Gram phương pháp nhuộm Gram
Vi khuẩn A.xylinum là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể phân biệt
với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép).
Tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn A.xylinum đem nhuộm tiêu bản theo
phương pháp Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus với độ phóng đại 1000 lần.
Mục đích của phương pháp nhuộm Gram là để phân biệt vi khuẩn Gram âm với vi khuẩn Gram dương. Nếu sau khi nhuộm kép mà tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gram âm. Ngược lại nếu tế bào bắt màu tím thì đó là vi khuẩn Gram dương. Khả năng bắt màu của vi khuẩm Gram âm và Gram dương khác nhau là do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Gram dương được cấu tạo từ một loại protein đặc biệt chứa muối nucleatmagie có
khả năng tạo màu tím với gentian và lugol tạo ra một phức chất bền, khó bị rửa trôi bởi cồn nên khi quan sát trên tiêu bản thấy tế bào vi khuẩn Gram dương bắt màu tím của gentian trong khi đó những vi khuẩn Gram âm không có khả năng tạo phức chất bền với thuốc nhuộm gentian và lugol nên dễ bị rửa trôi bởi cồn. Do đó, khi nhỏ fuchsin lên tế bào vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng - màu của fuchsin [3], [4], [5].
2.2.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi phân lập, được sơ bộ xác định là A.xylinum
được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày trong tủ ấm ở 300
C. Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 40C dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Cấy truyền và giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 2 tháng một lần [4], [5].
2.2.1.4. Phương pháp hoạt hoá giống
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210 trong 20 phút. Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [4], [5].
2.2.1.5. Phương pháp lên men tạo màng
Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1100C trong 20 phút để tránh phân rã đường. Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong 15 phút. Bổ sung vào môi trường dịch giống đã được hoạt hoá. Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh theo dõi sự tạo màng BC.
2.2.1.6. Phương pháp phát hiện khả năng tổng hợp cellulose
Nuôi cấy chủng vi khuẩn A.xylinum trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ phòng trong 3-4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt
màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60% thấy màng chuyển từ màu trắng đục sang màu xanh lam.
Qua đó, nhận thấy rằng chủng vi khuẩn A.xylinum đã được hoạt hóa và thuần chủng lại, đáp ứng được nhu cầu cho quá trình nghiên cứu của đề tài.
2.2.2. Phương pháp toán học
Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp sau: + Số trung bình cộng: dùng để tính các giá trị trung bình của các lần lặp
lại thí nghiệm. X = n i i X n 1 1
+ Trung bình bình phương các sai lệch: δ =
2 1 ( ) 1 n i i X M n
+ Sai số đại diện của trung bình cộng: ±m =
n
+ Hệ số biến thiên trung bình cộng: Cv = 100
M
Trong đó : M là trung bình cộng các chỉ số acid tạo thành n là số lần thí nghiệm
m là sai số đại diện của trung bình cộng lượng acid tạo thành X là chỉ số acid tạo thành trong các lần thí nghiệm
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát sự tạo màng của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum
BHN2 và CH14
Màng BC được hình thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy khi lên men acetic với sự tham gia của vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14, màng cần đáp ứng được các yêu cầu tiêu chuẩn sau: màng mỏng 2-3 mm, dai, bề mặt trơn, màu sáng, mùi dễ chịu.
Dựa vào môi trường cơ bản, chúng tôi thay đổi thành phần cacbon, nitơ và các yếu tố kích thích sinh trưởng để thiết lập môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14, theo dõi khả năng tạo màng, theo dõi khối lượng thô của màng nhằm tìm môi trường lên men thích hợp.
Bảng 3.1. Khả năng tạo màng BC trên các loại môi trƣờng khác nhau của chủng vi khuẩn A.xylinum
Đặc điểm MT3 MT4 MT5 MT6
Thời gian tạo màng 6 4 6 5
Tính chất của màng Khá dai Dai Dai Dai
Màu sắc của màng Màu sáng Vàng ngà Vàng đậm Trắng trong
Khối lượng của màng 3,45 3,52 3,59 3,65
Trong các môi trường có thành phần khác nhau, khả năng tạo màng của chủng A.xylinum cũng khác nhau: MT4 và MT5 là các môi trường có bổ sung pepton thì màng tạo thành có khả năng đàn hồi tốt tuy nhiên khối lượng màng BC thu được ở hai môi trường lại không đồng nhất, có màu vàng nên khi xử lý tốn rất nhiều thời gian và kinh phí. MT3 không được bổ sung pepton
hồi tốt, mùi thơm dịu và cho màng BC dày và khối lượng lớn nhất. MT6 là môi trường nước dừa già nguyên chất có chứa đường glucose và đường fructose tạo điều kiện thích hợp cho quá trình tổng hợp màng BC. Dựa vào mục đích nghiên cứu chúng tôi quyết định chọn MT6 là môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng, vitamin… cho màng BC đạt chỉ tiêu cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn
Acetobacterxylinum BHN2 và CH14
3.2.1 . Xác định hàm lượng acid acetic tạo thành của các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 Acetobacter xylinum BHN2 và CH14
Chúng tôi tiến hành kiểm tra hàm lượng acid acetic tạo thành nhằm xác định khả năng lên men và khả năng chịu đựng trong môi trường acid của các chủng. Trước hết nuôi cấy các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum đã tuyển
chọn được. Sau khi nuôi cấy 10 ngày, tiến hành chuẩn độ acid acetic tạo thành bằng NaOH 0,1N. Kết quả như sau:
Bảng 3.2. Khảo sát khả năng tạo thành acid acetic của các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum
STT Mẫu vi khuẩn M m (%) δ (%) Cv (%)
1 BHN2 1,17 0,020 0,040 3,419
2 CH14 1,11 0,035 0,060 5,000
Qua bảng ta thấy rằng các chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum đều có tạo thành acid acetic trong quá trình nuôi cấy. Hàm lượng acid acetic tạo thành đạt từ 1,0 – 1,2 %. Chính vì vậy vi khuẩn Acetobacter xylinum được sử dụng trong sản xuất giấm ăn (lên men giấm). Thực chất của quá trình này là sự oxy hóa rượu etylic không hoàn toàn tạo thành acid acetic trong môi trường sau:
3.2.2. Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum trên kính hiển vi quang học hiển vi quang học
3.2.2.1. Hình thái và tế bào học chủng vi khuẩn A.xylinum
Để quan sát hình dạng tế bào các vi khuẩn Acetobacter xylinum chúng tôi tiến hành làm tiêu bản và nhuộm Gram. Lấy mẫu váng hoặc dịch nuôi cấy hoặc vi khuẩn cấy trong ống thạch nghiêng làm tiêu bản và nhuộm Gram. Đưa lên kính hiển vi quang học để quan sát thấy rằng vi khuẩn A.xylinum là
những trực khuẩn Gram âm có dạng hình que đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi, không di động, bắt màu hồng fuchsin. Khi quan sát trên kính hiển vi điện tử thấy rõ các tế bào vi khuẩn dài có kích thước khoảng 2µm được bao bọc bởi chất nhầy tạo thành váng dầy bắt màu hồng (khi nhuộm bằng thuốc nhuộm iot và H2SO4 váng này bắt màu xanh). Trên kính hiển vi điện tử còn có thể quan sát thấy sự bắt màu đậm nhạt khác nhau của các phần khác nhau bên trong tế bào vi khuẩn.
Hình 3.1. Chủng giống vi khuẩn A.xylinum
Hình 3.2. Tế bào vi khuẩn A.xylinum
Kích thước tế bào 0,6 – 0,8 µm, có tiêm mao và có khả năng di động, sống hiếu khí bắt buộc, hóa dưỡng hữu cơ, không bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày.
3.2.2.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa
Trên môi trường thạch đĩa vi khuẩn A.xylium hình thành khuẩn lạc
Hình 3.3. Khuẩn lạc A.xylinum trên môi trƣờng thạch đĩa
Quan sát thấy khuẩn lạc có một số các đặc điểm sau:
Một số khuẩn lạc có hình tròn, phẳng, có bề mặt mịn, trơn, nhẵn
Một số có hình cầu, bóng như giọt mỡ với phần trung tâm dày, rắn, sẫm màu, phần xung quanh sáng hơn gần như không có màu
Một số khác có kích thước lớn hơn, bề mặt xù xì, khô, mép khuẩn lạc nhăn.
3.2.2.3. Hoạt tính catalase
Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc ta thấy có hiện tượng sủi bọt khí. Chứng tỏ oxy được giải phóng ra, hay nói cách khác dưới tác dụng của enzyme catalase phân giải H2O2 theo phương trình:
H2O2 catalase H2O + 1/2 O2
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của chủng A.xylinum
3.2.2.4. Khả năng sinh acid acetic của vi khuẩn A.xylinum với chất chỉ thị màu Blue bromphenol
Chất chỉ thị màu Blue bromphenol 0,04% vi khuẩn A.xylinum có khả năng chuyển hóa rượu etylic thành acid acetic làm môi trường chuyển từ màu xanh lục sang màu vàng.
Có thể giải thích như sau: Blue bromphenol là một chất chỉ thị màu cơ bản, bản thân phân tử có màu vàng, ion có màu lam. Khi dung dịch có pH:4,23 thì tỷ số giữa màu vàng và màu lam là 1, lúc đó nồng độ của chúng là như nhau, dung dịch có màu lục. Khi sử dụng môi trường nuôi cấy có pH> 4,6 thì số ion lam tăng, không nhìn thấy các phân tử màu vàng, dung dịch có màu lam.
Hình 3.5. Chuyển hóa rƣợu etylic thành acid acetic của vi khuẩn
A.xylinum
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum
BHN2 và CH14
3.3.1. Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14
Chúng tôi xác định quá trình sinh trưởng của 2 chủng này trên môi trường nhân giống số 6. Môi trường được khử trùng ở 0,5atm, thời gian để nguội là 30 phút. Sau khi khử trùng bổ sung thêm acid acetic và rượu etylic. Sau đó xác định số lượng tế bào ở các thời điểm 0h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h. Qua đó áp dụng phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu chúng tôi đã thu được kết quả ở bảng:
Bảng 3.3. Xác định số lƣợng tế bào của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14 Mẫu Giờ A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14 Mm δ Mm δ 0 8,00,03 0,02 100,20 0,04 24 17 0,53 0,05 23,00,15 0,03 48 51 1,50 1,32 53,00,33 0,57 72 83,0 1,70 2,15 78,50,00 0,00 96 97,04,0 1,56 90,03,07 1,15 120 103,05,00 6,30 95,02,50 4,70 144 90,04,70 3,30 80,03,42 5,70 168 703,30 5,12 72,03,34 6,50
Qua bảng chúng tôi dựa vào số liệu để xây dựng đồ thị 1 biểu diễn quá trình sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14
0 20 40 60 80 100 120 0 24 48 72 96 120 144 168 A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14
Hình 3.6 . Đồ thị biểu diễn quá trình sinh trƣởng của 2 chủng vi khuẩn
A.xylinum BHN2 và CH14
Nhận xét: Nhìn vào đồ thị 1 ta thấy rõ sự phát triển của 2 mẫu vi khuẩn
Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 theo một đường cong và có điểm cực đại ở 120h.
Tiếp tục nghiên cứu động thái phát triển của 2 mẫu trên chúng tôi tiến hành chuẩn độ dễ xác định hàm lượng acid acetic tạo thành qua các thời điểm đã định. Kết quả nghiên cứu được xử lý và trình bày ở bảng.
Bảng 3.4. Sự biến thiên hàm lƣợng acid acetic của 2 mẫu vi khuẩn
Acetobacterxylinum qua thời gian nuôi cấy khác nhau
Ký hiệu Lƣợng acid acetic tạo thành
0 24 48 72 96 120 144 168
BHN2 0,2 0,3 0,7 1,3 1,7 1,9 1,5 1,0
CH14 0,3 0,5 0,9 1,4 1,8 2,0 1,7 1,1
Dựa vào bảng chúng tôi xây dựng được đồ thị biểu diễn sự tạo thành lượng acid acetic của các mẫu qua các thời gian nghiên cứu khác.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 24 48 72 96 120 144 168 A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự tạo thành acid acetic trong dịch lên men của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 và CH14.
Qua nghiên cứu theo dõi quá trình phát triển của 2 chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 chúng tôi phân chia quá trình phát triển của vi khuẩn Acetobacter xylinum thành 4 thời kỳ phát triển kế tiếp nhau gồm 4 pha: pha tiềm phát, pha cấp số mũ, pha cân bằng, pha suy vong.
Từ 0-48h là pha tiềm phát: Trong pha này lượng acid acetic tăng chậm do vi khuẩn Acetobacter xylinum phải làm quen với môi trường tăng sinh khối tế bào
Từ 48-96h là pha cấp số mũ: Vi khuẩn Acetobacter xylinum phát triển
mạnh. Ở cuối pha lượng acid acetic tăng nhanh
Từ 96-120h là pha cân bằng: ở giai đoạn này số lượng tế bào tăng chậm và có thể không tăng do thiếu oxy hay bị nhiễm độc. Ở cuối pha lượng acid acetic đạt giá trị cực đại
Từ 125h trở đi là pha suy vong : Số lượng tế bào giảm do acid acetic ức chế ngược lại hoặc do môi trường thiếu chất dinh dưỡng
3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tạo màng của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 của 2 chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 và CH14
Để kiểm tra ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng tạo màng ở 2 chủng Acetobacter xylinum BHN2 và CH14 tôi sử dụng môi trường tiêu chuẩn có sự thay đổi nguồn cacbon (MT1, MT2, MT3, MT4, MT5).
Nguồn Cacbon sử dụng: Fructose, Sorbitol, Sacarose, Glucose, Ethanol Sau 120h thu màng, kiểm tra độ ảnh hưởng của cacbon tới độ dày màng . Kết quả thí nghiệm dẫn ra ở bảng sau:
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới độ dày màng BC (mm) Nguồn cacbon (mm) A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14 M δ ± m Cv M δ ± m Cv Fructose 1,40 0,015 0,087 1,07 1,20 0,05 0,003 0,4 Sorbitol 1,37 0,173 1,100 12,65 0,87 0,023 0,013 2,7 Sacarose 1,00 0,040 0,023 2,50 0,47 0,063 0,036 4,3 Glucose 2,50 0,010 0,006 2,00 2,47 0,023 0,013 4,9 Ethanol 1,53 2,735 1,580 77,50 1,43 0,363 0,209 8,2
Trong đó: M là giá trị trung bình tổng thể
± m là sai số đại diện của trung bình cộng δ là trung bình bình phương các sai biệt Cv là hệ số biến thiên trung bình (+) Số lần thí nghiệm: 3 lần (n=3)
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khối lƣợng tƣơi của màng (g/40ml) Nguồn cacbon (g/40ml) A.xylinum BHN2 A.xylinum CH14 n M δ ± m Cv n M δ ± m Cv