Môi trường nghiên cứu

5. Điểm mới

2.1.3. Môi trường nghiên cứu

Thành phần MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 1. Glucose 20 g 20 g 20 g 20 g 20 g 20 g 2. Agar 20 g 0 0 0 0 0 3. (NH4)2SO4 3 g 3 g 3 g 3 g 5 g 3 g 4. KH2PO4 2 g 2 g 2 g 2 g 2 g 2 g 5. MgSO4. 7H2O 2 g 2 g 2 g 2 g 0 2 g 6. Acid acetic 2% 2% 2% 2% 2% 2% 7. Pepton 0 5 g 0 3 g 5 g 0 8. Nước mía ép 0 0 0 200 ml 0 0 9. Nước dừa 0 0 0 0 0 1000 ml 10. Nước máy 1000 ml 1000 ml 1000 ml 800 ml 1000 ml 0

Chú ý: Acid acetic được bổ sung sau khi đã khử trùng môi trường Trong đó: MT1 là môi trường phân lập.

MT2 là môi trường nhân giống cơ bản.

MT3…MT6 là môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp vi sinh

2.2.1.1. Phương pháp phân biệt tế bào chủng A.xylinum BHN2 bằng phương pháp nhuộm Gram

Chủng A.xylinum BHN2 là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể phân biệt với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm kép). Tiến hành: Lấy chủng chủng A.xylinum BHN2 đem nhuộm tiêu bản theo phương pháp Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus với độ phóng đại 1000 lần [4], [16], [9].

2.2.1.2. Phương pháp bảo quản chủng A.xylinum BHN2 trên thạch nghiêng

Các chủng giống sau khi phân lập, sơ bộ xác định là chủng A.xylinum

BHN2 được cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4 - 5 ngày trong tủ ấm ở 300

15

Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 40C dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Cấy truyền và giữ giống trên thạch nghiêng khoảng 2 tháng một lần [5].

2.2.1.3. Phương pháp hoạt hoá giống

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210

trong 20 phút. Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy truyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [5], [18].

2.2.1.4. Phương pháp lên men tạo màng BC

Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1100

C trong 20 phút để tránh phân rã đường. Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong 15 phút. Bổ sung vào môi trường 10% giống hoạt hoá sau đó nuôi ở điều kiện tĩnh trong 4 – 8 ngày [14].

2.2.2. Các phương pháp hoá sinh

2.2.2.1. Phát hiện hoạt tính catalase

Nhỏ 1 giọt H2O2 3% lên khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (calatase +), nếu không thấy gì thì chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính calatase (calatase -). Ta có thể nhỏ trực tiếp H2O2 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu đã được tách từ dịch nuôi cấy bằng cách đem li tâm 6000 vòng/10phút, quan sát hiện tượng như trên.

2.2.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic

Để thử khả năng oxy hoá acid acetic, sử dụng môi trường: Cao nấm men: 10g Canxi acetat: 10g Thạch agar: 20g Nước máy: 1000ml pH : 7,0-7,2

16

Cho môi trường vào bình tam giác, rồi đem thanh trùng môi trường ở 121oC trong 20 phút, đổ thạch đĩa, để nguội, cấy vi khuẩn tuyển chọn mới được hoạt hoá (18-24 giờ) nuôi 3 – 4 ngày ở điều kiện thích hợp. Quan sát hiện tượng: Nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi là phản ứng dương tính, ngược lại là âm tính.

2.2.2.3. Phương pháp phát hiện khả năng tổng hợp cellulose

Nuôi vi khuẩn trong môi trường thử khả năng tạo màng (MT3), nuôi tĩnh ở nhiệt độ 28 – 300

C trong 3 – 4 ngày. Quan sát sự hình thành màng, kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên màng dung dịch lugol và H2SO4 60%, nếu là cellulose thì màng sẽ chuyển sang màu xanh lam.

2.2.2.4. Phương pháp xác định kh ả năng tổng hợp acid acetic bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị

Cho vào cốc thủy tinh (loại 100 ml hoặc 200 ml) dịch lên men , thêm vào đó 1 – 2 giọt phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Chú ý chuẩn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu h ồng nhạt. Sau đó tính số gam acid acetic trong 100 ml dung dịch lên men theo công thức:

Với : X : Số gam acid acetic trong 100 ml dung dịch lên men

V : Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 10 ml dung dịch lên men K : Lượng acid acetic tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N (K = 0,006) 10 : Số ml dịch lên men đem chuẩn độ

2.2.3. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng

Sau khi nuôi cấy, mang được lấy ra, để màng ráo nước khoảng 4 – 5 giờ, trên khay nhựa của nhiệt độ phòng thí nghiệm. Tiến hành cân màng trên cân điện tử. Trọng lượng tươi của màng được tính bằng hiệu số của trọng lượng khay nhựa lúc có và chưa có màng.

17

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu thống kê

Xử lý các kết quả thí nghiệm theo phương pháp trong cuốn “Ứng dụng tin học trong sinh học” [8], và “Thống kê và ứng dụng” [17] như:

Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm. 1 1 n i i X X n   

Trung bình bình phương các sai lệch:

1 ) ( 1 2      n X X n i i 

Sai số đại diện của trung bình cộng: m

n

  

Hệ số biến thiên trung bình cộng:

X x Cv   100

18

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng A.xylinum BHN2 3.1.1. Hình thái và tế bào học chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2

Chủng A.xylinum BHN2 nhận từ phòng Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2 (Hình 3.1)

Hình 3.1. Chủng giống vi khuẩn A.xylinum BHN2

Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi quang học Labomed (Mỹ) với độ phóng đại 1000 lần, tôi nhận thấy vi khuẩn A.xylinum BHN2 là trực khuẩn Gram âm có dạng hình que hay hình elip , đứng độc lập hay xếp chuỗi tuỳ vào điều kiện nhiệt độ và pH, một số có dạng hình bán nguyệt (hình 3.2)

Hình 3.2. Kết quả nhuộm Gram của A.xylinum BHN2

Kích thước tế bào 0,6 – 0,8 m, có thể có tiên mao và có khả năng di động, sống hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng hữu cơ, không sinh bào tử [2]. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày. Kết quả này cùng

19

phù hợp với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thúy Hương (2006) khi nghiên cứu về Acetobacter [6].

3.1.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa

Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn A.xylinum BHN2 hình thành

khuẩn lạc như hình 3.3:

Hình 3.3. A.xylinum BHN2 trên môi trường thạch đĩa

Khi quan sát trên hình 3.2 ta đo kích thước khuẩn lạc xác định được đường kính trung bình là 3mm. Các khuẩn lạc nhẵn bóng, có một số khuẩn lạc xù xì, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên, khi tách khuẩn lạc khỏi môi trường thấy dai, dễ tách.

3.1.3. Sinh trưởng trên môi trường lỏng

Vi khuẩn A.xylinum BHN2 nuôi cấy trong môi trường lỏng hình thành một lớp màng có màu trắng, bề mặt màng nhẵn, dai trên bề mặt nuôi cấy (hình 3.4)

20

Vi khuẩn A.xylinum BHN2 là loài vi khuẩn hiếu khí, khi sống ở trong môi trường lỏng có nguồn dinh dưỡng đầy đủ sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường glucose kết hợp với một số acid béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng. Tiền chất này tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hoá glucose thành cellulose, trên môi trường lỏng chúng phát triển thành màng BC.

3.1.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn A.xylinum BHN2 3.1.4.1. Hoạt tính catalase

Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tượng sủi bọt khí (hình 3.5). Chứng tỏ oxy được giải phóng ra, hay nói cách khác dưới tác dụng của enzyme catalase phân giải H2O2 theo phương trình:

2 2 2 2

1 2

Catalase

H O H O O

Hình 3.5. Hoạt tính catalase của chủng A.xylinum BHN2 3.1.4.2. Khả năng chuyển hóa glucose thành acid gluconic

Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường có chứa CaCO3 điều đó cho thấy acid gluconic đã được tạo thành (Hình 3.6). Chúng tham gia phản ứng với CaCO3 để chuyển môi trường từ màu trắng sang không màu.

21

Hình 3.6. Khả năng oxy hóa acetat của vi khuẩn A.xylinum BHN2

3.1.4.3. Khả năng sinh acid acetic của vi khuẩn A.xylinum BHN2 trên môi trường Blue bromphenol

Trong môi trường có Blue bromphenol 0,04% vi khuẩn A.xylinum

BHN2 có khả năng chuyển hóa rượu etylic thành acid acetic làm môi trường chuyển từ màu xanh lục sang màu vàng.

Có thể giải thích như sau: Blue bromphenol là một chất chỉ thị màu cơ bản, bản thân phân tử có màu vàng, ion có màu lam. Khi dung dịch có

pH: 4,23 thì tỷ số giữa phân tử màu vàng và màu lam là 1, lúc đó nồng độ của chúng là như nhau, dung dịch có màu lục. Khi sử dụng môi trường nuôi cấy có pH > 4,6 thì số ion màu lam tăng, không nhìn thấy các phân tử màu vàng, dung dịch có màu lam (hình 3.7)

Hình 3.7. Chuyển hóa rượu etylic thành acid acetic của vi khuẩn A.xylinum BHN2

22

Sau một thời gian nuôi cấy, pH môi trường nuôi cấy giảm, phân tử màu vàng tăng dần, dung dịch nuôi cấy có màu vàng.

3.1.4.4. Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose

Nhỏ dung dịch Lugol và H2SO4 60% lên mặt lớp màng BC sẽ xuất hiện màu lam.

Hình 3.8. Kết quả nhuộm màng BC

Qua hình 3.8 chứng tỏ A.xylinum BHN2 có khả năng hình thành màng cellulose.

Dựa theo khoá phân loại của Bergey (1992) [11], các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn acetic của Frateur 1950, căn cứ vào các kết quả khảo sát các đặc điểm sinh học của loài A.xylinum BHN2 có khả năng tạo màng sinh học BC sử dụng trong trị bỏng và nhiều ứng dụng khác.

3.2. Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau

Màng BC được hình thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy khi lên men acetic với sự tham gia của vi khuẩn A.xylinum BHN2, màng cần đáp ứng được các yêu cầu tiêu chuẩn sau: màng mỏng từ 2 – 3 mm, dai, bề mặt trơn, màu sáng, mùi dễ chịu. Vì vậy vấn đề nghiên cứu tìm được môi trường dinh dưỡng phù hợp mà lại đạt giá trị kinh tế cao là một vấn đề cần thiết.

Dựa vào môi trường cơ bản, chúng tôi thay đổi thành phần cacbon, nitơ và yếu tố kích thích sinh trưởng để thiết lập môi trường nuôi cấy chủng vi

23

khuẩn A.xylinum BHN2 , theo dõi khả năng tạo màng, đặc điểm của màng, theo dõi trọng lượng thô của màng nhằm tìm môi trường lên men thích hợp

Bảng 3.1. Khả năng tạo màng BC trên các loại môi trường khác nhau của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2

Đặc điểm MT3 MT4 MT5 MT6

Thời gian tạo màng 6 4 6 5

Tính chất của màng Khá dai Dai Dai Dai

Màu săc của màng Màu sáng Vàng ngà Vàng đậm Trắng trong Khối lượng của

màng

3,45 3,52 3,59 3,65

Trong các môi trường có thành phần khác nhau, khả năng tạo màng của chủng A.xylinum BHN2 cũng khác nhau: MT4 và MT5 là các môi trường có bổ sung pepton thì màng tạo thành có khả năng đàn hồi tốt, dai tuy nhiên khối lượng màng BC thu được ở hai môi trường lại không đồng nhất, có màu vàng nên khi sử lý rất tốn nhiều thời gian và kinh phí. MT3 không được bổ sung pepton màng BC tạo thành có đặc điểm kém hơn. MT6 cho màng BC dai, đàn hồi tốt mùi thơm dịu và cho màng BC dày và khối lượng lớn nhất. Điều này được giải thích do hàm lượng đường cung cấp có sự thay đổi: MT4 có bổ sung 200 ml nước mía nguyên chất (có chứa fructose), MT6 là môi trường nước dừa già nguyên chất có chứa đường glucose và đường fructose tạo điều kiện thích hợp cho quá trình tổng hợp màng BC. Dựa vào mục đích nghiên cứu tôi quyết định chọn MT6 là môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng, vitamin… cho màng BC đạt chỉ tiêu cho những nghiên cứu tiếp theo.

3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng tới khả năng tạo màng BC từ chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2

3.3.1. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose

Tôi sử dụng môi trường MT6 để lên màng với sự thay đổi hàm lượng nguồn glucose từ 17g/l tới 23g/l, sau 5 ngày nuôi cấy, tôi tiến hành thu nhận màng BC. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2:

24 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến màng BC Hàm lƣợng Glucose (g/l) Đặc điểm màng BC M ± m 17 Màng mỏng, dễ bị rách 2,87 ± 0,02 18 3,05 ± 0,01 19 Màng mỏng, dai, nhẵn (2-4mm) 3,43 ± 0,05 20 3,67 ± 0,05 21 3,79 ± 0,04 22

Màng dày, khá dai, không nhẵn 3,92 ± 0,03

23 4,05 ± 0,02

Hình 3.9. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến khối lƣợng tƣơi

màng BC

Dựa vào kết quả bảng 3.2 và hình 3.9 ta thấy rằng tỷ lệ màng BC hình thành phụ thuộc rất nhiều vào hàm lượng đường glucose. Nếu hàm lượng glucose nhỏ hơn 20g/l thì khối lượng BC thấp. Bởi vì trong quá trình lên men chỉ có khoảng 50% hàm lượng glucose tham gia vào hình thành màng BC, phần còn lại cung cấp cho hoạt động sống của tế bào. Do đó có thể nguồn

25

cacbon nhỏ hơn 20g/l dịch nuôi cấy sẽ không đủ cung cấp cho nhu cầu sống của tế bào vi khuẩn, nên lượng cellulose sẽ được sản sinh ra ít. Ngược lại hàm lượng glucose lớn hơn 23g/l vi khuẩn sẽ không sử dụng hết, lượng glucose sẽ được chuyển hoá thành acid gluconic làm cho pH môi trường giảm, ức chế quá trình tổng hợp cellulose, tốc độ tạo màng BC giảm và chất lượng màng không đảm bảo.

Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với nhiều kết quả đã đưa ra như tác giả Đặng Thị Hồng xác định glucose tốt nhất cho quá trình lên men tạo màng mỏng là 18 g/l [11], tác giả Schramm và Hestrin (1954) xác định là 20g/l [30].

Vậy hàm lượng glucose 20g/l là thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 lên men tạo màng mỏng.

Hình 3.10. Khả năng tạo màng BC ở nồng độ glucose 20g/l và 17g/l 3.3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4

Để kiểm tra ảnh hưởng của nguồn nitơ tới khả năng tạo màng BC ở chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 tôi quyết định sử dụng MT6 có sự thay đổi hàm lượng của (NH4)2SO4. Kết quả thu được thể hiện qua bảng sau:

26

Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến khối lƣợng tƣơi của màng BC Hàm lƣợng (NH4)2SO4 (g/l) Đặc điểm màng BC M ± m 1 Màng mỏng, dễ bị rách 3.19 ± 0,02 2 3.38 ± 0,01 3 Màng dày (2-3mm), nhẵn,dai 3.62 ± 0,03 4 Màng mỏng, nhẵn 3.51 ± 0,03 5 3.46 ± 0,01 6 3.32 ± 0,01

Hình 3.11. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến khối lượng tươi của màng BC

27

Từ bảng 3.3, hình 3.11 và hình 3.12 ta thấy rằng ở hàm lượng 3g/l vi khuẩn sẽ tạo ra màng BC dày nhất. Có thể giải thích kết quả thu được như sau:

Kết quả kiểm tra cho thấy, ở hàm lượng 3,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng BC cao nhất. Hàm lượng (NH4)2SO4 trên 3,0 g/l có thể là quá cao đối với yêu cầu của A.xylinum BHN2, do đó không hấp thụ hết lượng sulphate amone, lượng còn lại trong môi trường sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Vì vậy, lượng BC tạo ra thấp hơn so với môi trường có hàm lượng (NH4)2SO4

3,0 g/l. Còn hàm lượng (NH4)2SO4 dưới 2,0 g/l có thể là thấp hơn so với yêu cầu cho sự phát triển của vi khuẩn, nên lượng BC tạo ra thấp hơn. Tác giả Neelobon Suwannapinunt (2007) nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum trên môi trường nước dừa với tỷ lệ (NH4)2SO4 3 g/l [27], còn Saibuatong.O bổ sung 5 g/l (NH4)2SO4 trong lên men sản xuất thạch dừa [30].

Vậy (NH4)2SO4 với hàm lượng 3 g/l là thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 lên men tạo màng mỏng.

3.3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4

Phospho có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn