CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng tạo màngBC từ
3.3.1. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose
Tôi sử dụng môi trường MT6 để lên màng với sự thay đổi hàm lượng nguồn glucose từ 17g/l tới 23g/l, sau 5 ngày nuôi cấy, tôi tiến hành thu nhận màng BC. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2:
24 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến màng BC Hàm lƣợng Glucose (g/l) Đặc điểm màng BC M ± m 17 Màng mỏng, dễ bị rách 2,87 ± 0,02 18 3,05 ± 0,01 19 Màng mỏng, dai, nhẵn (2-4mm) 3,43 ± 0,05 20 3,67 ± 0,05 21 3,79 ± 0,04 22
Màng dày, khá dai, không nhẵn 3,92 ± 0,03
23 4,05 ± 0,02
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến khối lƣợng tƣơi
màng BC
Dựa vào kết quả bảng 3.2 và hình 3.9 ta thấy rằng tỷ lệ màng BC hình thành phụ thuộc rất nhiều vào hàm lượng đường glucose. Nếu hàm lượng glucose nhỏ hơn 20g/l thì khối lượng BC thấp. Bởi vì trong quá trình lên men chỉ có khoảng 50% hàm lượng glucose tham gia vào hình thành màng BC, phần còn lại cung cấp cho hoạt động sống của tế bào. Do đó có thể nguồn
25
cacbon nhỏ hơn 20g/l dịch nuôi cấy sẽ không đủ cung cấp cho nhu cầu sống của tế bào vi khuẩn, nên lượng cellulose sẽ được sản sinh ra ít. Ngược lại hàm lượng glucose lớn hơn 23g/l vi khuẩn sẽ không sử dụng hết, lượng glucose sẽ được chuyển hoá thành acid gluconic làm cho pH môi trường giảm, ức chế quá trình tổng hợp cellulose, tốc độ tạo màng BC giảm và chất lượng màng không đảm bảo.
Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với nhiều kết quả đã đưa ra như tác giả Đặng Thị Hồng xác định glucose tốt nhất cho quá trình lên men tạo màng mỏng là 18 g/l [11], tác giả Schramm và Hestrin (1954) xác định là 20g/l [30].
Vậy hàm lượng glucose 20g/l là thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 lên men tạo màng mỏng.
Hình 3.10. Khả năng tạo màng BC ở nồng độ glucose 20g/l và 17g/l 3.3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4
Để kiểm tra ảnh hưởng của nguồn nitơ tới khả năng tạo màng BC ở chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 tôi quyết định sử dụng MT6 có sự thay đổi hàm lượng của (NH4)2SO4. Kết quả thu được thể hiện qua bảng sau:
26
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến khối lƣợng tƣơi của màng BC Hàm lƣợng (NH4)2SO4 (g/l) Đặc điểm màng BC M ± m 1 Màng mỏng, dễ bị rách 3.19 ± 0,02 2 3.38 ± 0,01 3 Màng dày (2-3mm), nhẵn,dai 3.62 ± 0,03 4 Màng mỏng, nhẵn 3.51 ± 0,03 5 3.46 ± 0,01 6 3.32 ± 0,01
Hình 3.11. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến khối lượng tươi của màng BC
27
Từ bảng 3.3, hình 3.11 và hình 3.12 ta thấy rằng ở hàm lượng 3g/l vi khuẩn sẽ tạo ra màng BC dày nhất. Có thể giải thích kết quả thu được như sau:
Kết quả kiểm tra cho thấy, ở hàm lượng 3,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng BC cao nhất. Hàm lượng (NH4)2SO4 trên 3,0 g/l có thể là quá cao đối với yêu cầu của A.xylinum BHN2, do đó không hấp thụ hết lượng sulphate amone, lượng còn lại trong môi trường sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Vì vậy, lượng BC tạo ra thấp hơn so với môi trường có hàm lượng (NH4)2SO4
3,0 g/l. Còn hàm lượng (NH4)2SO4 dưới 2,0 g/l có thể là thấp hơn so với yêu cầu cho sự phát triển của vi khuẩn, nên lượng BC tạo ra thấp hơn. Tác giả Neelobon Suwannapinunt (2007) nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum trên môi trường nước dừa với tỷ lệ (NH4)2SO4 3 g/l [27], còn Saibuatong.O bổ sung 5 g/l (NH4)2SO4 trong lên men sản xuất thạch dừa [30].
Vậy (NH4)2SO4 với hàm lượng 3 g/l là thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 lên men tạo màng mỏng.
3.3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4
Phospho có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn nên khi thay đổi nồng độ hợp chất phospho trong môi trường sẽ dẫn đến thay đổi các quá trình tổng hợp hàng loạt các chất hợp phần có chứa phospho, tế bào chất và chất nhân. Phospho ngoài việc tham gia cấu tạo nên thành phần của tế bào nó còn có vai trò hết sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở vi khuẩn A.xylinum BHN2.
Tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của KH2PO4 đến quá trình hình thành màng của vi khuẩn A.xylinum BHN2 ở các nồng độ khác nhau. Kết quả thu được như sau:
28
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng KH2PO4 đến khối lƣợng tƣơi của màng BC Hàm lƣợng KH2PO4 (g/l) Đặc điểm màng BC M ± m 0 Màng mỏng, dễ rách 1,06 ± 0,02 1 2,98 ± 0,02 2 Màng dày, dai, nhẵn 3,59 ± 0,01 3 Màng mỏng, sần sùi 3,31 ± 0,01 4 2,57 ± 0,03
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng KH2PO4 đến khối lƣợng tƣơi màng BC
29
Qua bảng 3.4, hình 3.13 và hình 3.14 cho thấy, ở hàm lượng 2,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng BC cao nhất.
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ảnh hưởng khối lượng màng nhưng chủ yếu là do phospho và kali có nhiều trong thành phần cấu tạo quan trọng của tế bào như: acid nucleic, protein, phospholipid và nhiều coenzyme quan trọng như ADP, ATP, NADP,.... tham gia vào quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic đến CO2 và H2O. Khi hàm lượng KH2PO4 từ 3g/l trở lên sẽ dẫn tới dư thừa nó làm thay đổi đặc tính lý hóa của môi trường, ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn dẫn tới ảnh hưởng đến sự hình thành màng BC. Ngược lại nếu lượng phospho kali quá thấp (dưới 1g/l) sẽ ảnh hưởng tới việc cấu thành coezyme xúc tác cho phản ứng trong quá trình sinh trưởng. Ở hàm lượng KH2PO4 từ 1 – 3 g/l cho màng BC với khối kượng và chất lượng cao. Kết quả nghiên cứu của tôi phù hợp với tác giả Schramm và Hestrin sử dụng KH2PO4 là 2,7g/l [30].
Vậy KH2PO4 với hàm lượng 2g/l là thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 lên men tạo màng mỏng.
3.3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O
Chúng ta cần phải cung cấp một lượng magie khá cao cho vi sinh vật. Magie mang tính chất của một cofactor, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa. Ngoài ra magie giữ vai trò quan trọng trong việc làm liên kết các tiểu phần ribosome với nhau [4].
Tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của MgSO4.7H2Ođến quá trình hình thành màng của vi khuẩn A.xylinum BHN2 ở các nồng độ khác nhau. Kết quả thu được thể hiện qua bảng 3.5:
30
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng MgSO4.7H2O đến khối lƣợng tƣơi của màng BC Hàm lƣợng MgSO4.7H2O (g/l) Đặc điểm màng BC M ± m 0 Màng mỏng, dễ rách 1,06 ± 0,01 1 2,53 ± 0,02 2 3,12 ± 0,01 3 Màng dày, dai, nhẵn 3,58 ± 0,02 4 Màng mỏng, sần sùi 3,39 ± 0,03 5 3,27 ± 0,03
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng MgSO4.7H2O đến khối lƣợng tƣơi của màng BC
31
Từ bảng 3.5, hình 3.15 và hình 3.16, ta thấy rằng MgSO4.7H2O ở hàm lượng 3g/l cho khối lượng màng tươi cao nhất. Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung magie là nhân tố tham gia vào việc tạo thành enzyme, những enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa các chất trong quá trình hình thành màng BC. Nếu lượng magie không đủ cung cấp cho việc tạo thành những enzyme thì sẽ ảnh hưởng tới quá trình hình thành cellulose nên khối lượng màng thấp. Ngược lại lượng magie quá cao sẽ gây ức chế cho quá trình tạo màng BC.
Vậy MgSO4.7H2O với hàm lượng 3g/l là thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 lên men tạo màng mỏng.
3.4. Ảnh hƣởng của thời gian tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2
Khi nuôi cấy A.xylinum BHN2 trong MT6 đã được thanh trùng ở 1100C trong vòng 20 phút, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, nhận thấy:
Trong ngày đầu, số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy tăng nhưng ở mức độ chậm. Vì ở giai đoạn này vi khuẩn làm quen với môi trường, tích lũy chất dinh dưỡng và năng lượng cho các giai đoạn tiếp theo. Đồng thời với quá trình tăng trưởng tế bào thì lượng acid cũng bắt đầu hình thành, pH môi trường giảm nhẹ.
Ngày thứ 2, màng BC bắt đầu được hình thành trên bề mặt môi trường, tăng nhanh cho tới ngày thứ 5. Sau đó màng chìm xuống dần và khối lượng màng giảm dần do bị phân hủy.
32
Bảng 3.6. Khối lƣợng tƣơi của màng BC qua thời gian nuôi cấy
Thời gian (ngày) Đặc điểm M ± m
2 Màng rất mỏng, nhẵn 1,35 ± 0,03
3 Màng rất mỏng, dai, nhẵn 2,49 ± 0,03
4 Màng mỏng, dai, nhẵn 3,23 ± 0,02
5 Màng mỏng, dai, nhẵn 3,68 ± 0,01
6 Màng tương đối dày, khá dai 3,82 ± 0,01 7 Màng dày, khá dai, không nhẵn 3,79 ± 0,02
8 Màng dày, kéo dễ rách 3,65 ± 0,02
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi khối lượng màng BC qua thời gian nuôi cấy
33
Dựa vào bảng 3.6, hình 3.17 và hình 3.18 giải thích như sau:
Khối lượng màng của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 tăng dần theo thời gian nuôi cấy. thời gian nuôi cấy càng dài thu được khối lượng màng BC càng lớn. Nhưng đến một giới hạn nhất định màng BC quá dày dẫn đến việc vận chuyển các chất qua màng gặp khó khăn, hoạt động tế bào giảm, khả năng kết tinh của các sợi cellulose kém dần làm màng dễ bị kéo rách. Để đáp ứng mục đích nghiên cứu tôi quyết định thu màng sau 5 ngày nuôi cấy. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Đặng Thị Hồng (2007) [11]
Vậy để thu được màng đạt tiêu chuẩn mỏng, dai, nhẵn thì tôi thu màng sau 5 ngày nuôi cấy ở môi trường tĩnh.
3.5. Khảo sát khả năng tạo màng ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau
3.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hình thành màng BC
Nhiệt độ không những ảnh hưởng đến sinh trưởng mà còn quyết định đến khả năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2. Nhiệt độ thấp vi khuẩn sinh trưởng chậm, thời gian nuôi cấy kéo dài làm ảnh hưởng tới khả năng tổng hợp cellulose. Ngược lại nhiệt độ quá cao sẽ dẫn đến hô hấp quá mạnh cũng ảnh hưởng tới khả năng tổng hợp cellulose. Để xác định nhiệt độ tốt nhất cho quá trình lên men, chúng tôi tiến hành nuôi cấy ở 6 mức nhiệt khác nhau. Kết quả thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hình thành màng BC Nhiệt độ(t0 C) Đặc điểm của màng BC M ± m 20 Không hình thành màng, chỉ có các sợi cellulose nhỏ - 25 Màng rất mỏng, khá dai, nhẵn 2,65 ± 0,02 30 Màng mỏng, dai, nhẵn 3,72 ± 0,01 35 Màng mỏng, dai, nhẵn 3,38 ± 0,01 40 Không hình thành - 45 Không hình thành -
34
Hình 3.19. Khả năng tạo màngBC ở thời gian 250C và 300C
Từ bảng 3.7 và hình 3.19 cho thấy: chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2
sinh trưởng và tổng hợp cellulose thích hợp nhất ở nhiệt độ 25 – 350
C. Khả năng hình thành màng lớn nhất ở 350C. Nhiệt độ trên 350C ức chế hoạt động tổng hợp cellulose. Theo tác giả Hoong – Joo Son và cs (2002) nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum BHN2 trong điều kiện nuôi cấy lắc, nhiệt độ là 25 – 300C, nhiệt độ tốt nhất là 300C.
Vậy nhiệt độ là 300C thuận lợi cho vi khuẩn A.xylinum BHN2 sinh trưởng phát triển lên men tạo màng BC và màng đạt giá trị tốt nhất.
3.5.2. Ảnh hưởng của pH đến hình thành màng BC
Giá trị pH được đo bằng nồng độ các ion H+ và OH- có trong môi trường, pH của môi trường ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp tới tính chất sinh lý của tế bào nên ảnh hưởng đến khả năng hình thành màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 [3].
Để xác định khoảng pH thích hợp cho tế bào sinh trưởng tạo màng BC, tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường có giá trị pH khác nhau ở 300C trong 5 ngày. Kết quả thu được ở bảng 3.8:
35 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC pH Đặc điểm của màng BC X m 2 Màng không hình thành - 3 Màng mỏng khoảng 1mm, khá dai 1,47 ± 0,01 4 Màng mỏng 2 – 4 mm, dai, bề mặt nhẵn 2,98 ± 0,02 5 Màng mỏng 2 – 4 mm, dai, bề mặt nhẵn 3,51± 0,02 6 Màng mỏng 2 – 4mm, dai, bề mặt nhẵn 3,24 ± 0,02 7 Màng không hình thành - 8 Màng không hình thành -
Hình 3.20. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC
36
Từ bảng 3.8, hình 3.20 và hình 3.21 cho thấy pH: 4 – 6 thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn A.xylinum BHN2 lên men tạo màng BC. Khi tôi sử dụng MT6 (môi trường nước dừa) có pH: 5 tương ứng với kết quả nghiên cứu là ở pH: 5 đạt khối lượng màng cao nhất.
Kết quả nghiên cứu của tôi phù hợp với nghiên cứu của Hestrin và Schramm (1954) xác định giá trị pH tối ưu là 5 [30].
Vậy pH: 5 phù hợp với sinh trưởng phát triển của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 lên men tạo màng BC và màng đạt giá trị tốt nhất.
37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 là chủng cho màng BC đáp ứng yêu cầu màng sinh học sử dụng trong trị bỏng.
1.2. Sự hình thành màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 tốt nhất ở MT6 gồm Glucose: 20g/l, (NH4)2SO4 : 3g/l, KH2PO4: 2g/l, MgSO4. 7H2O: 2g/l, nước dừa 1000ml.
1.3. Sự hình thành màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 tốt nhất trong môi trường dinh dưỡng gồm:
Glucose: 20g/l (NH4)2SO4 : 3g/l KH2PO4: 2g/l MgSO4.7H2O: 3g/l
1.4. Sau 5 ngày nuôi cấy ở môi trường tĩnh ta thu được màng mỏng, dai, nhẵn đạt tiêu chuẩn.
1.5. Sự hình thành màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 tốt nhất trong điều kiện nuôi cấy là t0: 300C, pH: 5.
2.Đề nghị
Do thời gian có hạn nên tôi không thể nghiên cứu ảnh hưởng của tất cả các yếu tố môi trường tới quá trình hình thành màng BC của chủng vi khuẩn
A.xylinum BHN2. Để có màng BC có chất lượng tốt, mang lại hiệu quả kinh tế cao cần phải tiếp tục nghiên cứu:
38
2.1. Ảnh hưởng của các yếu tố như : Pepton, tỷ lệ S/V,…
2.2. Các khâu trong quá trình xử lý màng BC.
2.3. Cách xử lý bảo quản, đóng gói màng.
39
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
[1]. Nguyễn Lân Dũng (1976). Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1 - 2 - 3. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hà Nội.
[2]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, (1998). Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục.
[3]. Nguyễn Thành Đạt, (1999). Cơ sở sinh học vi sinh vật. Nxb Giáo dục [4]. Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990). Thực
hành vi sinh vật. Nxb Giáo dục, trang 17 - 92.
[5]. Vũ Thị Minh Đức (2001). Thực tập vi sinh vật. Nxb ĐHQG Hà Nội, trang 1 - 50.
[6]. Nguyễn Thúy Hương (2006). Chọn lọc dùng Acetobacter xylinum thích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn. Luận án tiến sỹ khoa học sinh học, trường Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
[7]. Nguyễn Đức Lượng (2000). Công nghệ Vi sinh vật, tập 1 - 2 - 3. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. HCM.
[8]. Chu Văn Mẫn (2003). Ứng dụng tin học trong sinh học. Nxb ĐHQG Hà Nội.
[9]. Nguyễn Văn Mùi (2001). Thực hành hóa sinh học. Nxb ĐHQG Hà Nội. [10]. Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006). Nghiên cứu các đặc
tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng. Số 361, Tạp chí dược học.
40
[11]. Đặng Thị Hồng, (2007). Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học (BC). Luận án thạc sĩ Sinh học ĐHSP Hà Nội.
[12]. Nguyễn Thị Nguyệt, Đinh Thị Kim Nhung (2005). Nghiên cứu Acetobacter xylinum cho màng Bacterial cellulose (BC) làm mặt nạ dưỡng da. Tạp chí Khoa học, số 4, Đại học Sư phạm Hà Nội 2, trang 127-138. [13]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân (2010). Nghiên cứu một số
đặc tính sinh học của vi khuẩn Acetorbacter xylinum phân lập từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam. Tạp chí thông tin Y dược - Bộ Y tế, trang 62 - 65.
[14]. Đinh Thị Kim Nhung (1996). Nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter và ứng dụng lên men acetic theo phương pháp chìm. Luận án