5. Điểm mới
3.1.3. Sinh trưởng trên môi trường lỏng
Vi khuẩn A.xylinum BHN2 nuôi cấy trong môi trường lỏng hình thành một lớp màng có màu trắng, bề mặt màng nhẵn, dai trên bề mặt nuôi cấy (hình 3.4)
20
Vi khuẩn A.xylinum BHN2 là loài vi khuẩn hiếu khí, khi sống ở trong môi trường lỏng có nguồn dinh dưỡng đầy đủ sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường glucose kết hợp với một số acid béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng. Tiền chất này tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hoá glucose thành cellulose, trên môi trường lỏng chúng phát triển thành màng BC.
3.1.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn A.xylinum BHN2 3.1.4.1. Hoạt tính catalase
Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tượng sủi bọt khí (hình 3.5). Chứng tỏ oxy được giải phóng ra, hay nói cách khác dưới tác dụng của enzyme catalase phân giải H2O2 theo phương trình:
2 2 2 2
1 2
Catalase
H O H O O
Hình 3.5. Hoạt tính catalase của chủng A.xylinum BHN2 3.1.4.2. Khả năng chuyển hóa glucose thành acid gluconic
Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường có chứa CaCO3 điều đó cho thấy acid gluconic đã được tạo thành (Hình 3.6). Chúng tham gia phản ứng với CaCO3 để chuyển môi trường từ màu trắng sang không màu.
21
Hình 3.6. Khả năng oxy hóa acetat của vi khuẩn A.xylinum BHN2
3.1.4.3. Khả năng sinh acid acetic của vi khuẩn A.xylinum BHN2 trên môi trường Blue bromphenol
Trong môi trường có Blue bromphenol 0,04% vi khuẩn A.xylinum
BHN2 có khả năng chuyển hóa rượu etylic thành acid acetic làm môi trường chuyển từ màu xanh lục sang màu vàng.
Có thể giải thích như sau: Blue bromphenol là một chất chỉ thị màu cơ bản, bản thân phân tử có màu vàng, ion có màu lam. Khi dung dịch có
pH: 4,23 thì tỷ số giữa phân tử màu vàng và màu lam là 1, lúc đó nồng độ của chúng là như nhau, dung dịch có màu lục. Khi sử dụng môi trường nuôi cấy có pH > 4,6 thì số ion màu lam tăng, không nhìn thấy các phân tử màu vàng, dung dịch có màu lam (hình 3.7)
Hình 3.7. Chuyển hóa rượu etylic thành acid acetic của vi khuẩn A.xylinum BHN2
22
Sau một thời gian nuôi cấy, pH môi trường nuôi cấy giảm, phân tử màu vàng tăng dần, dung dịch nuôi cấy có màu vàng.
3.1.4.4. Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose
Nhỏ dung dịch Lugol và H2SO4 60% lên mặt lớp màng BC sẽ xuất hiện màu lam.
Hình 3.8. Kết quả nhuộm màng BC
Qua hình 3.8 chứng tỏ A.xylinum BHN2 có khả năng hình thành màng cellulose.
Dựa theo khoá phân loại của Bergey (1992) [11], các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn acetic của Frateur 1950, căn cứ vào các kết quả khảo sát các đặc điểm sinh học của loài A.xylinum BHN2 có khả năng tạo màng sinh học BC sử dụng trong trị bỏng và nhiều ứng dụng khác.
3.2. Khảo sát khả năng tạo màng ở các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau
Màng BC được hình thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy khi lên men acetic với sự tham gia của vi khuẩn A.xylinum BHN2, màng cần đáp ứng được các yêu cầu tiêu chuẩn sau: màng mỏng từ 2 – 3 mm, dai, bề mặt trơn, màu sáng, mùi dễ chịu. Vì vậy vấn đề nghiên cứu tìm được môi trường dinh dưỡng phù hợp mà lại đạt giá trị kinh tế cao là một vấn đề cần thiết.
Dựa vào môi trường cơ bản, chúng tôi thay đổi thành phần cacbon, nitơ và yếu tố kích thích sinh trưởng để thiết lập môi trường nuôi cấy chủng vi
23
khuẩn A.xylinum BHN2 , theo dõi khả năng tạo màng, đặc điểm của màng, theo dõi trọng lượng thô của màng nhằm tìm môi trường lên men thích hợp
Bảng 3.1. Khả năng tạo màng BC trên các loại môi trường khác nhau của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2
Đặc điểm MT3 MT4 MT5 MT6
Thời gian tạo màng 6 4 6 5
Tính chất của màng Khá dai Dai Dai Dai
Màu săc của màng Màu sáng Vàng ngà Vàng đậm Trắng trong Khối lượng của
màng
3,45 3,52 3,59 3,65
Trong các môi trường có thành phần khác nhau, khả năng tạo màng của chủng A.xylinum BHN2 cũng khác nhau: MT4 và MT5 là các môi trường có bổ sung pepton thì màng tạo thành có khả năng đàn hồi tốt, dai tuy nhiên khối lượng màng BC thu được ở hai môi trường lại không đồng nhất, có màu vàng nên khi sử lý rất tốn nhiều thời gian và kinh phí. MT3 không được bổ sung pepton màng BC tạo thành có đặc điểm kém hơn. MT6 cho màng BC dai, đàn hồi tốt mùi thơm dịu và cho màng BC dày và khối lượng lớn nhất. Điều này được giải thích do hàm lượng đường cung cấp có sự thay đổi: MT4 có bổ sung 200 ml nước mía nguyên chất (có chứa fructose), MT6 là môi trường nước dừa già nguyên chất có chứa đường glucose và đường fructose tạo điều kiện thích hợp cho quá trình tổng hợp màng BC. Dựa vào mục đích nghiên cứu tôi quyết định chọn MT6 là môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng, vitamin… cho màng BC đạt chỉ tiêu cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng tới khả năng tạo màng BC từ chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2
3.3.1. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose
Tôi sử dụng môi trường MT6 để lên màng với sự thay đổi hàm lượng nguồn glucose từ 17g/l tới 23g/l, sau 5 ngày nuôi cấy, tôi tiến hành thu nhận màng BC. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2:
24 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến màng BC Hàm lƣợng Glucose (g/l) Đặc điểm màng BC M ± m 17 Màng mỏng, dễ bị rách 2,87 ± 0,02 18 3,05 ± 0,01 19 Màng mỏng, dai, nhẵn (2-4mm) 3,43 ± 0,05 20 3,67 ± 0,05 21 3,79 ± 0,04 22
Màng dày, khá dai, không nhẵn 3,92 ± 0,03
23 4,05 ± 0,02
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng glucose đến khối lƣợng tƣơi
màng BC
Dựa vào kết quả bảng 3.2 và hình 3.9 ta thấy rằng tỷ lệ màng BC hình thành phụ thuộc rất nhiều vào hàm lượng đường glucose. Nếu hàm lượng glucose nhỏ hơn 20g/l thì khối lượng BC thấp. Bởi vì trong quá trình lên men chỉ có khoảng 50% hàm lượng glucose tham gia vào hình thành màng BC, phần còn lại cung cấp cho hoạt động sống của tế bào. Do đó có thể nguồn
25
cacbon nhỏ hơn 20g/l dịch nuôi cấy sẽ không đủ cung cấp cho nhu cầu sống của tế bào vi khuẩn, nên lượng cellulose sẽ được sản sinh ra ít. Ngược lại hàm lượng glucose lớn hơn 23g/l vi khuẩn sẽ không sử dụng hết, lượng glucose sẽ được chuyển hoá thành acid gluconic làm cho pH môi trường giảm, ức chế quá trình tổng hợp cellulose, tốc độ tạo màng BC giảm và chất lượng màng không đảm bảo.
Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với nhiều kết quả đã đưa ra như tác giả Đặng Thị Hồng xác định glucose tốt nhất cho quá trình lên men tạo màng mỏng là 18 g/l [11], tác giả Schramm và Hestrin (1954) xác định là 20g/l [30].
Vậy hàm lượng glucose 20g/l là thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 lên men tạo màng mỏng.
Hình 3.10. Khả năng tạo màng BC ở nồng độ glucose 20g/l và 17g/l 3.3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4
Để kiểm tra ảnh hưởng của nguồn nitơ tới khả năng tạo màng BC ở chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 tôi quyết định sử dụng MT6 có sự thay đổi hàm lượng của (NH4)2SO4. Kết quả thu được thể hiện qua bảng sau:
26
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng (NH4)2SO4 đến khối lƣợng tƣơi của màng BC Hàm lƣợng (NH4)2SO4 (g/l) Đặc điểm màng BC M ± m 1 Màng mỏng, dễ bị rách 3.19 ± 0,02 2 3.38 ± 0,01 3 Màng dày (2-3mm), nhẵn,dai 3.62 ± 0,03 4 Màng mỏng, nhẵn 3.51 ± 0,03 5 3.46 ± 0,01 6 3.32 ± 0,01
Hình 3.11. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến khối lượng tươi của màng BC
27
Từ bảng 3.3, hình 3.11 và hình 3.12 ta thấy rằng ở hàm lượng 3g/l vi khuẩn sẽ tạo ra màng BC dày nhất. Có thể giải thích kết quả thu được như sau:
Kết quả kiểm tra cho thấy, ở hàm lượng 3,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng BC cao nhất. Hàm lượng (NH4)2SO4 trên 3,0 g/l có thể là quá cao đối với yêu cầu của A.xylinum BHN2, do đó không hấp thụ hết lượng sulphate amone, lượng còn lại trong môi trường sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Vì vậy, lượng BC tạo ra thấp hơn so với môi trường có hàm lượng (NH4)2SO4
3,0 g/l. Còn hàm lượng (NH4)2SO4 dưới 2,0 g/l có thể là thấp hơn so với yêu cầu cho sự phát triển của vi khuẩn, nên lượng BC tạo ra thấp hơn. Tác giả Neelobon Suwannapinunt (2007) nuôi cấy vi khuẩn A.xylinum trên môi trường nước dừa với tỷ lệ (NH4)2SO4 3 g/l [27], còn Saibuatong.O bổ sung 5 g/l (NH4)2SO4 trong lên men sản xuất thạch dừa [30].
Vậy (NH4)2SO4 với hàm lượng 3 g/l là thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 lên men tạo màng mỏng.
3.3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4
Phospho có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn nên khi thay đổi nồng độ hợp chất phospho trong môi trường sẽ dẫn đến thay đổi các quá trình tổng hợp hàng loạt các chất hợp phần có chứa phospho, tế bào chất và chất nhân. Phospho ngoài việc tham gia cấu tạo nên thành phần của tế bào nó còn có vai trò hết sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở vi khuẩn A.xylinum BHN2.
Tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của KH2PO4 đến quá trình hình thành màng của vi khuẩn A.xylinum BHN2 ở các nồng độ khác nhau. Kết quả thu được như sau:
28
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng KH2PO4 đến khối lƣợng tƣơi của màng BC Hàm lƣợng KH2PO4 (g/l) Đặc điểm màng BC M ± m 0 Màng mỏng, dễ rách 1,06 ± 0,02 1 2,98 ± 0,02 2 Màng dày, dai, nhẵn 3,59 ± 0,01 3 Màng mỏng, sần sùi 3,31 ± 0,01 4 2,57 ± 0,03
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng KH2PO4 đến khối lƣợng tƣơi màng BC
29
Qua bảng 3.4, hình 3.13 và hình 3.14 cho thấy, ở hàm lượng 2,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng BC cao nhất.
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ảnh hưởng khối lượng màng nhưng chủ yếu là do phospho và kali có nhiều trong thành phần cấu tạo quan trọng của tế bào như: acid nucleic, protein, phospholipid và nhiều coenzyme quan trọng như ADP, ATP, NADP,.... tham gia vào quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic đến CO2 và H2O. Khi hàm lượng KH2PO4 từ 3g/l trở lên sẽ dẫn tới dư thừa nó làm thay đổi đặc tính lý hóa của môi trường, ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn dẫn tới ảnh hưởng đến sự hình thành màng BC. Ngược lại nếu lượng phospho kali quá thấp (dưới 1g/l) sẽ ảnh hưởng tới việc cấu thành coezyme xúc tác cho phản ứng trong quá trình sinh trưởng. Ở hàm lượng KH2PO4 từ 1 – 3 g/l cho màng BC với khối kượng và chất lượng cao. Kết quả nghiên cứu của tôi phù hợp với tác giả Schramm và Hestrin sử dụng KH2PO4 là 2,7g/l [30].
Vậy KH2PO4 với hàm lượng 2g/l là thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 lên men tạo màng mỏng.
3.3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O
Chúng ta cần phải cung cấp một lượng magie khá cao cho vi sinh vật. Magie mang tính chất của một cofactor, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa. Ngoài ra magie giữ vai trò quan trọng trong việc làm liên kết các tiểu phần ribosome với nhau [4].
Tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của MgSO4.7H2Ođến quá trình hình thành màng của vi khuẩn A.xylinum BHN2 ở các nồng độ khác nhau. Kết quả thu được thể hiện qua bảng 3.5:
30
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng MgSO4.7H2O đến khối lƣợng tƣơi của màng BC Hàm lƣợng MgSO4.7H2O (g/l) Đặc điểm màng BC M ± m 0 Màng mỏng, dễ rách 1,06 ± 0,01 1 2,53 ± 0,02 2 3,12 ± 0,01 3 Màng dày, dai, nhẵn 3,58 ± 0,02 4 Màng mỏng, sần sùi 3,39 ± 0,03 5 3,27 ± 0,03
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng MgSO4.7H2O đến khối lƣợng tƣơi của màng BC
31
Từ bảng 3.5, hình 3.15 và hình 3.16, ta thấy rằng MgSO4.7H2O ở hàm lượng 3g/l cho khối lượng màng tươi cao nhất. Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung magie là nhân tố tham gia vào việc tạo thành enzyme, những enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa các chất trong quá trình hình thành màng BC. Nếu lượng magie không đủ cung cấp cho việc tạo thành những enzyme thì sẽ ảnh hưởng tới quá trình hình thành cellulose nên khối lượng màng thấp. Ngược lại lượng magie quá cao sẽ gây ức chế cho quá trình tạo màng BC.
Vậy MgSO4.7H2O với hàm lượng 3g/l là thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 lên men tạo màng mỏng.
3.4. Ảnh hƣởng của thời gian tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2
Khi nuôi cấy A.xylinum BHN2 trong MT6 đã được thanh trùng ở 1100C trong vòng 20 phút, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, nhận thấy:
Trong ngày đầu, số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy tăng nhưng ở mức độ chậm. Vì ở giai đoạn này vi khuẩn làm quen với môi trường, tích lũy chất dinh dưỡng và năng lượng cho các giai đoạn tiếp theo. Đồng thời với quá trình tăng trưởng tế bào thì lượng acid cũng bắt đầu hình thành, pH môi trường giảm nhẹ.
Ngày thứ 2, màng BC bắt đầu được hình thành trên bề mặt môi trường, tăng nhanh cho tới ngày thứ 5. Sau đó màng chìm xuống dần và khối lượng màng giảm dần do bị phân hủy.
32
Bảng 3.6. Khối lƣợng tƣơi của màng BC qua thời gian nuôi cấy
Thời gian (ngày) Đặc điểm M ± m
2 Màng rất mỏng, nhẵn 1,35 ± 0,03
3 Màng rất mỏng, dai, nhẵn 2,49 ± 0,03
4 Màng mỏng, dai, nhẵn 3,23 ± 0,02
5 Màng mỏng, dai, nhẵn 3,68 ± 0,01
6 Màng tương đối dày, khá dai 3,82 ± 0,01 7 Màng dày, khá dai, không nhẵn 3,79 ± 0,02
8 Màng dày, kéo dễ rách 3,65 ± 0,02
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi khối lượng màng BC qua thời gian nuôi cấy
33
Dựa vào bảng 3.6, hình 3.17 và hình 3.18 giải thích như sau:
Khối lượng màng của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2 tăng dần theo thời gian nuôi cấy. thời gian nuôi cấy càng dài thu được khối lượng màng BC càng lớn. Nhưng đến một giới hạn nhất định màng BC quá dày dẫn đến việc vận chuyển các chất qua màng gặp khó khăn, hoạt động tế bào giảm, khả năng kết tinh của các sợi cellulose kém dần làm màng dễ bị kéo rách. Để đáp ứng mục đích nghiên cứu tôi quyết định thu màng sau 5 ngày nuôi cấy. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Đặng Thị Hồng (2007) [11]
Vậy để thu được màng đạt tiêu chuẩn mỏng, dai, nhẵn thì tôi thu màng sau 5 ngày nuôi cấy ở môi trường tĩnh.
3.5. Khảo sát khả năng tạo màng ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau
3.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hình thành màng BC
Nhiệt độ không những ảnh hưởng đến sinh trưởng mà còn quyết định đến khả năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum BHN2. Nhiệt độ thấp vi khuẩn sinh trưởng chậm, thời gian nuôi cấy kéo dài làm ảnh hưởng tới khả năng tổng hợp cellulose. Ngược lại nhiệt độ quá cao sẽ dẫn đến hô hấp quá mạnh cũng ảnh hưởng tới khả năng tổng hợp cellulose. Để xác định nhiệt độ tốt nhất cho quá trình lên men, chúng tôi tiến hành nuôi cấy ở 6 mức nhiệt khác nhau. Kết quả thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hình thành màng BC Nhiệt độ(t0 C) Đặc điểm của màng BC M ± m 20 Không hình thành màng, chỉ có các sợi cellulose nhỏ - 25 Màng rất mỏng, khá dai, nhẵn 2,65 ± 0,02 30 Màng mỏng, dai, nhẵn 3,72 ± 0,01 35 Màng mỏng, dai, nhẵn 3,38 ± 0,01 40 Không hình thành - 45 Không hình thành -
34
Hình 3.19. Khả năng tạo màngBC ở thời gian 250C và 300C