2.5.1. Phương pháp vi sinh vật
2.5.1.1.Phương pháp đếm khuẩn lạc [6]
Phương pháp đến khuẩn lạc là phương pháp cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. Tế bào sống có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Đây là phương pháp tốt nhất để xác định mật độ tế bào trong mẫu, độ nhậy cao, định lượng vi sinh vật ở nồng độ thấp, nhưng khả năng sai số lớn cần phải lặp lại nhiều lần trên một độ pha loãng.
Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa. Nuôi ở 300C trong 5 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức.
1000 1 . . 10 i n i N A V (1)
Trong đó N : Tổng số CFU trong 1ml mẫu ban đầu.
Ai : Số khuẩn lạc trung bình tạo vòng phân giải CaCO3 trên đĩa phân lập có độ pha loãng 10-n.
Vi : Thể tích dịch mẫu trên mỗi đĩa phân lập. 10-n : Là độ pha loãng của mẫu phân lập.
2.5.1.2. Phương pháp đo độ đục [3]
Khi sinh trưởng trên môi trường lỏng, các tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum có thể làm đục môi trường. Để xác định số lượng tế bào trong dung dịch nuôi cấy, chúng tôi dùng phương pháp soi màu dịch nuôi cấy bằng máy quang phổ tử ngoại (HenleH.Packard-Đức) ở bước sóng λ=610nm. Các bước tiến hành như sau:
Phí Văn Tá K33B – SP Sinh 28
Bước 1: Thiết lập đồ thị chuẩn về mối tương quan giữa số lượng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum trong dung dịch nuôi cấy với giá trị OD đo được ở bước sóng 610nm.
- Ly tâm 6 ependoff có chứa 1ml dịch nuôi cấy 20h 10000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch thu sinh khối. Sau đó bổ sung vào mỗi ependoff chứa sinh khối 1ml nước cất vô trùng và đem vôntex. Hút hết dịch trong các ependoff cho vào 1 ống nghiệm ta được ống gốc ban đầu (100).
- Pha loãng ống gốc ở độ pha loãng 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64. Đo giá trị OD ở bước sóng λ=610nm của các độ pha loãng tương ứng phía trên.
- Pha loãng ống gốc 10-5 lần. Lấy ống nghiệm đã pha loãng 10-5 pha loãng 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64 lần. Ở mỗi độ pha loãng này lấy 100μl trang đều vào các hộp petri có chứa môi trường dinh dưỡng đã khử trùng (3 hộp/độ pha loãng). Nuôi trong tủ ấm, sau 5 ngày đếm số khuẩn lạc mọc trong hộp petri ở mỗi độ pha loãng.
Đo OD các dung dịch pha loãng ở bước sóng 610nm với mẫu đối chứng là dung dịch sinh lý vô trùng. Đồng thời xác định số lượng CFU trong dịch pha loãng bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Từ kết quả đo OD ở bước sóng 610nm và số lượng CFU đếm được trên mỗi độ pha loãng, chúng tôi tiến hành lập phương trình hồi quy tuyến tính (
hàm tương quan), xác định các hệ số của phương trình hồi quy và các hệ số tương quan. Dựa trên phương pháp toán học này, chúng tôi đã xử lý kết quả bằng phần mềm Microsft office Excel 2003 và đã thu được đồ thị chuẩn của hàm hồi quy như sau:
Phí Văn Tá K33B – SP Sinh 29 Hình 2.5. Đồ thị mối tương quan giữa giá trị OD 610nm và số lượng tế bào
Đồ thị đường chuẩn có dạng y = 13,019.107 x +48772 với độ chính xác R2 =0,9969. Mối liên hệ giữa x và y là rất chặt chẽ, kết quả đo được là đáng tin cậy.
Bước 2: Xác định giá trị OD đo được ở λ = 610nm của dịch lên men, dựa vào đồ thị chuẩn để tính số lượng tế bào có trong dịch lên men tại các thời điểm khác nhau.
2.5.1.3.Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram[6]
Vai trò: Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi khuẩn dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protit đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt.
Tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum đem nhuộm tiêu bản theo phương pháp Gram. Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học Olympus CH-2 với độ phóng đại 100 lần.
2.5.1.4. Bảo quản chủng giống
a) Bảo quản trên thạch nghiêng [3], [6]
Các khuẩn lạc sau khi phân lập và xác định sơ bộ là vi khuẩn
Acetobacter cấy chuyển sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng,
y = 130.19x + 4.8772 R2 = 0.9969 0 20 40 60 80 100 120 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Giá trị OD 610nm S ố t ế b à o ( x 1 0 0 0 0 0 0 )
Phí Văn Tá K33B – SP Sinh 30
nuôi 3 ngày ở tủ ấm 28-30oC. Sau đó giữ trong tủ lạnh 4oC cho nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần.
b) Bảo quản trong dung dịch glycerin 24% [18]
Các chủng có khả năng hình thành cellulose được nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng ở 30oC sau 48 giờ đem li tâm dịch nuôi cấy trong 20 phút ở 3000 vòng/ phút, tách lấy phần sinh khối. Hoà đều sinh khối trong 1ml dung dịch glycerin 24% vô trùng giữ ở -75oC trong các ống eppendof vô trùng. Bảo quản theo phương pháp này cho phép giữ giống trong vòng 1 đến 3 năm.
2.5.2. Phương pháp hoá sinh
2.5.2.1. Phát hiện hoạt tính catalase [3]
Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +). Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -).
Ngoài ra có thể nhỏ trực tiếp H2O2 3% lên sinh khối tế bào của chủng nghiên cứu đã được tách từ dịch nuôi cấy bằng cách đem li tâm 5000vòng/10phút, quan sát hiện tượng như trên.
Phí Văn Tá K33B – SP Sinh 31 2.5.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá rượu êtylic thành acid acetic
Nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi trường bao gồm: Cao nấm men: 10g Rượu êtylic: 10%-15% (vol/vol) Nước máy : 1000ml pH : 6,8-7.0
Blue Bromophenol (BPB) 0,04%: 20ml
Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5ml), khử trùng ở 1210C trong 20 phút, để nguội khoảng 30oC cấy vi khuẩn nghiên cứu mới hoạt hoá, nuôi 7 ngày trong điều kiện thích hợp. Quan sát thấy môi trường chuyển sang màu vàng là dương tính, không đổi màu là âm tính.
Pha dung dịch BPB 0,04%: cân 0,1g BPB nghiền nhỏ trong cốc sứ, sau đó bổ sung 14,9 ml NaOH 0,001N hoà tan cho đều. Đổ tất cả vào bình định mức thêm nước cho đến khi thể tích đạt 250ml [4].
2.5.2.3. Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic
Sử dụng môi trường sau để thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn.
Thành phần: Cao nấm men: 10g Canxi acetat: 10g Thạch agar : 20g Nước máy : 1000ml pH : 7,0-7,2
Phân môi trường vào bình tam giác đem khử trùng ở 121oC trong 20 phút, để nguội khoảng 40-45oC đổ thạch đĩa, cấy vi khuẩn tuyển chọn mới hoạt hoá (18-24 giờ) nuôi 6-7 ngày ở điều kiện thích hợp. Quan sát hiện tượng: Nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi là phản ứng dương tính, ngược lại là âm tính.
Phí Văn Tá K33B – SP Sinh 32
Hình 2.7. Vòng phân giải CaCO3 của vi khuẩn A.xylinum BHN2
2.5.2.4. Phát hiện khả năng chuyển hoá glucose thành acid [14]
Để xác định khả năng hình thành acid của chủng vi khuẩn tuyển chọn chúng tôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch GCP. Nếu xung quanh chuẩn lạc tạo vòng phân giải canxi, chứng tỏ chủng tuyển chọn có khả năng hình thành acid từ glucose.
2.5.2.5. Phát hiện khả năng chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton [14]
Để thử khả năng hình thành dihydroxyaceton từ glycerol. Chúng tôi tiến hành nuôi vi khuẩn trong môi trường bao gồm thành phần sau:
Glycerol: 4% CaCO3: 0,3% (NH4)2SO4 : 0,1% Cao nấm men: 0,3 % Thạch : 2g Cao ngô: 3% pH: 5,3 H2O : 1000ml
Hấp thanh trùng 120oC trong 10 phút. Để môi trường nguội cấy giống vi khuẩn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 30oC trong vòng 48h.
Nhỏ dung dịch Fehling vào 1ml dịch nuôi cấy trong ống eppendorf để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyaceton (có sự xuất hiện kết tủa Cu2O màu đỏ gạch).
Cách pha dung dịch Fehling [3], [6]
Fehling 1: CuSO4.5H2O: 34,6g Nước cất : 500ml
Fehling 2: Na.K.Tartrat: 173g NaOH: 70g, Nước cất: 500ml
Trộn Fehling 1 và Fehling 2 theo tỷ lệ 1:1 ta được dung dịch Fehling màu xanh thẫm.
Phí Văn Tá K33B – SP Sinh 33 2.5.2.6. Sinh trưởng trên môi trường Hoyer [10]
Thành phần môi trường: (g/l)
(NH4)2SO4 : 1g KH2PO4: 0,9g FeCl3.6H2O : 0,02g MgSO4.7H2O : 0,25g K2HPO4: 0,1g Rượu êtylic 99,5%: 20ml Hấp thanh trùng 121oC trong 15 phút. Để môi trường nguội bổ sung giống nghiên cứu nuôi ở nhiệt độ khoảng 30oC trong 0, 12, 24, 48 giờ sau đó hút 1mml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf ly tâm ở 5000 vòng trong 10 phút và xác định giá trị OD ở λ = 610nm.
2.5.2.7. Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28-30oC trong vòng 3-4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60% nó chuyển hoá thành màu xanh lam.
2.5.3. Phương pháp vật lý
2.5.3.1. Độ bền cơ học
Trong quá trình ứng dụng trị bỏng, màng BC cần chịu được một số lực tác động. Do vậy, chỉ tiêu về độ bền cơ học của màng là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng của màng. Trong khuôn khổ điều kiện cơ sở vật chất hạn hẹp của phòng thí nghiệm, tôi chỉ có thể nghiên cứu độ bền cơ học của màng BC một cách tương đối theo phương pháp đơn giản:
Chọn ngẫu nhiên 4 màng BC thử nghiệm độ bền cơ học theo chiều kéo dọc và theo chiều kéo ngang bằng phương pháp đơn giản: dùng lực kế lò xo kéo màng theo chiều ngang chiều dọc, xác định độ bền kéo của màng.
Phí Văn Tá K33B – SP Sinh 34 2.5.3.2. Khảo sát khả năng thấm hút của màng
Nghiên cứu khả năng thấm hút của màng BC đối với nước, dịch nghệ, kháng sinh.
Mô hình 1: Khảo sát khả năng thấm hút của màng BC, màng được ngâm trong nước, dịch nghệ, kháng sinh sau đó cân ở những khoảng thời gian khác xác định ( 2, 4, 6, 12, 24, 36 giờ ) để tính được lượng nước mà màng hút được.
Mô hình 2: Màng BC đắp lên bề mặt những hộp lồng chứa thạch có nồng độ 0,3% để thử khả năng thấm hút của màng (đối với nước) trong những khoảng thời gian xác định (2, 4, 6, 12, 24, 36 giờ).
2.5.3.3. Khảo sát khả năng ngăn cản vi sinh vật của màng
Khảo sát khả năng ngăn cản vi sinh vật (xạ khuẩn và vi khuẩn) của màng BC và so sánh với vải gạc vô trùng đang lưu hành trên thị trường. Tiến hành đặt các hộp lồng có chứa môi trường dinh dưỡng và được che phủ màng BC (màng BC được xử lí qua NaOH, tẩm dịch nghệ, tẩm kháng sinh trị bỏng), gạc vô trùng ở ngoài không khí, và hộp lồng chứa môi trường dinh dưỡng mở lắp trong điều kiện của phòng thí nghiệm trong 24 giờ. Đưa vào tủ ấm 350C và quan sát trong những ngày tiếp theo.
2.5.3.4. Độ thấu khí của màng BC
Độ thấu khí (air permeability): là đặc tính của màng biểu thị khả năng cho phép không khí đi qua cấu trúc xơ sợi của nó, được xác định bằng phương pháp thử tiêu chuẩn [TCVN 6891: 2006].
Khi hàng rào da bị tổn thương, cần phải có hàng rào bảo vệ để ngăn cẳn sự xâm nhập của vi khuẩn, tránh làm khô bề mặt vết thương nhưng đồng thời cũng phải có sự thông thoáng đảm bảo cung cấp dưỡng khí để kích thích cho quá trình tái tạo biểu mô.
2.5.4. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp trong cuốn “Ứng dụng tin học trong sinh học” [12], và “Thống kê và ứng dụng” [16] như:
Phí Văn Tá K33B – SP Sinh 35
* Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm. 1 1 n i i X X n
* Trung bình bình phương các sai lệch:
1 ) ( 1 2 n X X n i i
* Sai số đại diện của trung bình cộng: m n
* Hệ số biến thiên trung bình cộng:
X x Cv 100
2.5.5. Phương pháp xử lý màng BC từ Acetobacter xylinum
Màng BC thu trực tiếp từ dịch nuôi cấy được qua các bước xử lí sau [14], [18].
Bảng 2.6. Các bước xử lý màng BC
Các bước Cách xử lý Kết quả
1 - Rửa sạch bằng nước máy - Loại bỏ bớt acid axetic
2 - Đun với NaOH 0,5% ở 100
0 C trong thời gian 30 phút
- Màu sắc của màng: vàng - Mùi hơi khét
3 - Trung hoà bằng nước chanh
loãng
- Màu sắc của màng từ vàng sậm chuyển sang trắng trong
4 - Ngâm với NaOH 0,5N ở nhiệt
độ phòng trong 24h
- Màng BC trắng trong, không mùi đạt cảm quan
5 - Trung hoà lại bằng nước
Phí Văn Tá K33B – SP Sinh 36
- Tạo màng BC có kích thước 15x10 cm.
- Chúng tôi tiến hành tạo độ ẩm màng BC theo phương pháp sấy khô (ở nhiệt độ 50oC trong 24h), dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu. Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong màng.
- Các loại thuốc để ngâm màng: dầu mù u, dịch nghệ, kháng sinh Cephalexin (kháng sinh thông dụng trong trị bỏng).
- Bổ sung Tween 20 tỷ lệ 0,1% vào các lô thí nghiệm để nhũ tương hóa tinh dầu.
- Ngâm màng BC đã xử lý với các loại hợp chất dầu mù u, dịch nghệ ép, kháng sinh Cephalexin.
2.5.6. Phương pháp tạo vết thương hở trên thỏ thí nghiệm, dùng màng đắp lên vết thương hở [14]
- Chọn mô hình gây bỏng bằng nhiệt khô (nhiệt độ 1000C) dùng miếng kim loại nung nóng trên ngọn lửa trong 30 giây, thời gian gây bỏng là 5 giây tại vùng da đã được cạo lông ở thỏ, độ bỏng II nông, diện tích bỏng bằng 18- 20% diện tích cơ thể.
- Sau khi gây bỏng, tiến hành đắp màng ngay lên vết bỏng và thay màng sau 24 giờ.
Phương pháp đánh giá kết quả
+ Theo dõi tình trạng vết thương: có nhiễm trùng hay không
Phí Văn Tá K33B – SP Sinh 37
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Khả năng thấm hút nước của màng BC từ chủng A. xylinum BHN2
3.1.1. Khả năng thấm hút nước của màng BC từ chủng A. xylinum BHN2
Khả năng thấm hút của màng là một trong những tiêu chuẩn quan trọng của màng trị bỏng. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên 2 mô hình (phần 2.5.3.2):
Kết quả thử nghiệm đo khả năng thấm nước của màng BC thể hiện qua bảng 3.7 và bảng 3.8
Bảng 3.7. Lượng nước hút được của màng BC – Theo mô hình 1
(số gam nước hút được trên 150 cm2 của màng BC)
Thời gian Xm (%) Cv (%) 2h 7.03 0.02 0.044 0.625 4h 9.31 0.02 0.036 0.386 6h 11.0 0.02 0.036 0.33 12h 13.17 0.02 0.036 0.27 24h 14.82 0.02 0.044 0.29 36h 14.82 0.02 0.044 0.29
Phí Văn Tá K33B – SP Sinh 38
Bảng 3.8. Lượng nuớc hút đuợc của màng BC – Theo mô hình 2
(trên môi trường thạch bán lỏng)
Thời gian Xm (%) Cv (%) 2h 0.04 0.01 0.02 0.50 4h 0.17 0.01 0.02 0.11 6h 0.21 0.005 0.01 0.47 12h 0.35 0.01 0.02 0.57 24h 0.58 0.01 0.02 0.34 36h 0.58 0.01 0.02 0.34
Kết quả khảo sát trên mô hình 1 để thấy được khả năng thấm hút nước