tạo
3.4.1.1. Phương pháp ựể ẩm
Sau khi ựiều tra thu thập ựược mẫu bệnh (lá, thân, cành,) ngoài ựồng ruộng chúng tôi chọn mẫu có triệu chứng ựiển hình, rửa sạch ựất cát, cắt thành mẫu thắch hợp ựể trong hộp Petri có lót giấy ẩm, ựể ở nhiệt ựộ thắch hợp sau 2-3 ngày có ựộ ẩm thường xuyên, ựem kiểm tra dưới kắnh hiển vi ựể xác ựịnh sơ bộ tác nhân gây bệnh.
3.4.1.2. Phương pháp chế tạo môi trường:
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng các loại môi trường nhân tạo PGA, PCA, WA,
* Môi trường PGA: Thành phần
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 125
+ Khoai tây: 200 gram + Agar: 20 gram + đường glucose: 20 gram + Nước cất: 1000 ml
điều chế môi trường: Khoai tây gọt sạch vỏ, thái lát mỏng, ựem ựun sôi với nước cất 30 phút, sau ựó cho lọc bằng vải mỏng qua phễụ Cho thêm nước cất ựủ 1000 ml ựem ựun sôi lạị
Cho vào lần lượt, Agar khuấy ựều cho tan hết, sau ựó ựổ môi trường vào bình tam giác, hay ống nghiệm có ựậy nút giấy bạc (Bình tam giác, ống nghiệm, hộp petri ựã ựược rửa sạch và sấy khô ở nhiệt ựộ 1800C trong hai giờ). Sau ựó ựem khử trùng trong nồi hấp áp suất 1.5atm (1210C) trong 30 phút.
Môi trường ựã khử trùng ựể phân lập nuôi cấy nấm, có thể bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ < 00C.
* Môi trường PCA Thành phần:
+ Khoai tây: 100 gram + Agar: 20 gram + Cà rốt: 100 gram + Nước cất: 1000 ml
Cách chế tạo (1000 ml): tương tự như môi trường PGA * Môi trường WA
Thành phần:
+ Agar: 20 gram + Nước cất: 1000 ml
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 126
Cách chế tạo: đun tan Agar trong nước cất sau ựó khử trùng. Cách làm tương tự các môi trường trên.
3.4.1.3 Phương pháp phân lập nấm
- Mẫu bệnh ựiển hình tươi mới ngoài ựồng ruộng, chúng tôi ựem về phân lập và nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo trong phòng thắ nghiệm ựể tạo ựược nguồn nấm bệnh thuần khiết (Isolate) làm vật liệu nghiên cứụ
- Cách phân lập mẫu bệnh:
+ Bệnh phân lập lấy từ các vết trên lá (thân, cành, rễ) có triệu chứng ựiển hình còn tươi mới ựưa về phòng thắ nghiệm, rửa sạch ựất bụi bằng nước máỵ Dùng dao ựã khử trùng cắt (0.2 Ờ 0.3) miếng cắt có phần mô khỏe và mô bệnh, sau ựó khử trùng trong dung dịch HgCl2 0.1% trong 1 phút, tiếp tục rửa sạch bằng nước cất 2 Ờ 3 lần, rồi thấm khô bằng giấy lọc vô trùng. Dùng que cấy khử trùng (dùng cồn ựốt lên ngọn lửa) ựể nguội, cấy mô lên môi trường nhân tạọ Toàn bộ quá trình phân lập ựược thực hiện trong ựiều kiện vô trùng và cách ly ở ổ cấy ( khi phân lập phải khử trùng que cấy và hé mở ựĩa petri trên ngọn lửa ựèn cồn).
+ Sau khi nấm mọc, tiến hành cắt ựầu sợi nấm cấy truyền sang các ống nghiệm khác từ 4 Ờ 5 lần cho ựến khi thu ựược nguồn nấm thuần khiết (Isolate). Quan sát ựặc ựiểm hình thái, màu sắc sợi nấm. Khi ựã có nấm, tản nấm và bào tử phân sinh, cành bào tử và các cấu trúc của nấm. Khi ựã có nấm thuần khiết tiến hành các thắ nghiệm trong phòng.