47 9981 Lọ trồng ếch Thanh Hóa
2.2.3.Phương pháp tách chiết AND theo CTAB Ngày thứ nhất:
CTAB Ngày thứ nhất:
1. Thu 30g lá lúa, nghiền mịn trong ni tơ lỏng. 2. Bổ sung 450ml SEB-M lạnh.
3. ủ trên đá 10 phút, khuấy nhẹ. 4. Lọc bằng màng vải 2 lần.
5. Bổ sung 1/20 thể tích SEB-MT (có chứa Triton), ủ trên đá 10 phút, khuấy nhẹ. 6. Li tâm 650 X g, 10 phút, 4°c ừong ống 250ml.
7. Bỏ dịch nổi, hòa tan tủa vào 20ml SEB-M.
8. Li tâm ở 650 X g, 10 phút, 4°c trong Falcon 15ml. 9. Bỏ dịch nổi, hòa tan tủa vào 20ml SEB-M.
10. Li tâm ở 650 X g, 10 phút, 4°c ưong Falcon lml. 11. Bỏ dịch nổi, hòa tan tủa vào 7,5 ml SEB-M.
12.Bổ sung 20% SDS (w/v) (đến nồng độ cuối cùng là 2% ). Đảo nhẹ đều. 13.ủ trong bể ổn nhiệt 60°c trong 10 phút, để về nhiệt độ phòng.
14.Bổ sung 5M sodium perchlorate (20°C) đến nồng độ cuối cùng là IM. 15.Li tâm 400 X g trong 20 phút để loại tinh bột.
16.Thu dịch nổi.
17.Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ trong 15 phút.
18.Li tâm 3000 X g trong 10 phút.
19.Thu dịch nổi.
20.Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ trong 15 phút. Thu dịch nổi.
21. Chuyển sang màng thẩm tích, ngâm trong TE (pH7.0) ở 4°c qua đêm. Ngày
22.Chuyển dịch từ màng sang falcon 15ml.
23.Bổ sung RNase TI 50U/ml ADN RNase A 50 ug/ml, ủ ở 37°c trong 45 phút. 24.Bổ sung Proteinase K đến nồng độ 150 |Lig/ml ủ ở 37°c trong 45 phút.
25.Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ trong 15 phút.
26.Li tâm ở 3000 X g ừong 10 phút.
27.Chuyển dịch nổi sang Ốngl5ml.
28.Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ 15 phút, Li tâm ở 3000 X g trong 10 phút.
29.Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) lắc nhẹ 15 phút. 30.Li tâm ở 3000 X g trong 10 phút.
Chuyển dịch nổi sang Ốngl5ml.
32. Bổ sung tỉ lệ 1:1 thể tích Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) lắc nhẹ 15 phút, ly tâm ở 3000 X g trong 10 phút, Chuyển dịch nổi sang Ốngl5ml.
33. Bổ sung 1/10 thể tích 3M sodium acetate (pH5.2). 34. Chuyển sang ống li tâm đáy tròn.
35. Bổ sung 2-2.5 thể tíchl00% ethanol và lắc nhẹ. 36. Li tâm 14,000 RPM trong 30 phút ở 4°c.
37. Rửa bằng lml 70% ethanol, Li tâm 14,000 RPM trong 15 phút ở 4°c.
38. Loại bỏ dịch và để khô ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. 39. Hòa tan ADN bằng 500^,1 H20.