văt
về cơ bản, một quy trình tách chiết ADN hệ gen từ bất kỳ tế bào prokaryotic hay eukaryotic đều gồm ba bước cơ bản, (1) Phá vỡ lớp bao phủ quanh ADN (màng/thành tế bào), (2) Phân lập ADN khỏi tất cả các thành phần khác trong tế bào (mảnh vỡ thành tế bào và các vật chất trao đổi chất), (3) Duy trì tính toàn vẹn của ADN trong suốt quá trình. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tách chiết ADN.
1.2.5.1. Nguồn vật liệu và quá trình thực hiện
Sự có mặt của thành tế bào polysaccharide cứng trong cấu trúc các tế bào thực vật gây tương đối khó khăn trong việc tách chiết ADN. Do vậy, trước khi
quyết định lựa chọn quy trình tách chiết từ nguồn vật liệu thực vật cần phải quan tâm đến một số yếu tố sau:
Loại mô và độ già của mô
Độ già của mô là loại mô ảnh hưởng rất lớn đến số lượng và chất lượng trong việc tách chiết ADN. Những mô non, khỏe mạnh, mềm, đặc biệt là những lá đang trong thời kỳ phát triển là một sự lựa chọn lí tưởng để có thể thu được ADN có chất lượng tốt và số lượng lớn do có lượng tế bào nhiều, trong khi tinh bột và các chất chuyển hóa thứ cấp có ít (Peterson, D. G et al., 1997) [36]. Những lá non héo vàng cũng là một nguồn vật liệu rất tốt cho việc tách chiết ADN. Để các cây sinh trưởng trong bóng tối 3-4 ngày trước khi thu lá để tách chiết giúp cho quá trình tách chiết hiệu quả hơn (Puchooa, D et aỉ., 2004) [40]. Ngược lại, ADN tách chiết từ những lá trưởng thành thu được số lượng và chất lượng ADN kém hơn do có nhiều các polyphenol, tannin, polysaccharide và các chất chuyển hóa thứ cấp, những chất đó gắn với ADN tạo thành một hỗn hợp nhày hoặc tạo nên sản phẩm có màu nâu không phù họp và gây khó khăn cho những thí nghiệm sau (Sarwat, M et ah,
2006) [46]. Ngoài lá ra, những phần khác của cây như thân, rễ, hạt, phôi, .. .đều có thể cũng sử dụng được phụ thuộc vào tùy loại cây và sự sẵn có của mô.
Cách thu thập và bảo quản
Cách xử lý và bảo quản các mô thực vật thích hợp sau khi thu thập là một yếu tố càn phải được quan tâm trong quy trình. Đối với tách chiết ADN, vật liệu từ cây thường được thu thập lúc tươi và xử lý trực tiếp trong quy trình, hoặc được bảo quản ở -18°c, -80°c hoặc ừong Nitơ lỏng để đóng băng mẫu trước khi sử dụng. Phải làm lạnh để ngăn cản sự hoạt động của nuclease nếu không sẽ làm giảm ADN ừong mô đã rã đông. Trong trường hợp không thể làm lạnh ngay các mẫu thu thập được như ở trên đồng ruộng, hay những vùng xa xôi, thì có thể bảo quản mô trong những dung dịch như cetyltrimethylammonium bromide bão hòa (CTAB)-NaCl-NaN3 (Bhattacharjee, Rv et al., 2004) [7], hoặc những vật liệu đã được làm khô như silica gel và sau đó bảo quản để tránh bị nhiễm bẩn do nước đọng lại. Các mẫu được bảo quản dưới hình thức đông lạnh là
lựa chọn tốt nhất cũng như cho phép bảo quan trong nhiều năm mà chất lượng ADN giảm đi không nhiều.
Đồng họp chất hóa
Trong các tế bào thực vật, sự có mặt của thành tế bào polysaccharide cứng khiến sự phá vỡ các mô có một chút phức tạp, chiếm khoảng 30-70% tổng thời gian yêu cầu cho quá trình xử lý mẫu. Trong trường họp này, mức độ sử dụng các yếu tố vật lý tác động vào ADN làm giảm sản phẩm, lực tác động vật lý để phá vỡ thành tế bào đủ để làm đứt gãy ADN có trọng lượng phân tử cao (Muưay, M. G et al., 1980) [32]. Đồng họp chất hóa là rất cần thiết để làm giảm độ nhớt do các hợp chất có trọng lượng phân tử cao như các carbohydrate phức tạp (Wilson, K et al., 1994) [54]. Một sự khác biệt lớn của các phương pháp phá vỡ theo vật lý được sử dụng như nghiền mô bằng máy nghiền, chày cối, que thủy tinh hoặc kim loại, bi thủy tinh... Nghiền mô trong Nitơ lỏng làm lạnh đột ngột là một biện pháp được ưa chuộng và phổ biến hơn, phương pháp này nhanh, áp dụng được cho cả mô mềm và mô cứng lại cũng tránh được sự tạp nhiễm khi thực hiện với số lượng mẫu lớn (Kuta, D. D et al, 2005) [26]. Hạn chế lớn nhất đối với Nitơ lỏng đó là phương pháp lưu trữ đặc biệt và giá thảnh cao, khiến chúng không thích hợp cho những phòng thí nghiệm còn thiếu thốn trang thiết bị (Kang, T. J et al., 2004) [25].
Bên cạnh những phương pháp phá vỡ mô nhờ vật lý cho những mô có đồng hợp chất, thì những phương pháp phá võ nhờ hóa chất thích hợp cũng có thể rất hữu dụng. Phương pháp này cũng tốn kém và cũng có thể làm phá vỡ và làm đứt gãy ADN thu được do tác động của những hóa chất được sử dụng. Các hóa chất phá vỡ mô chủ yếu bao gồm các enzym thủy phân như cellulases, pectinases hoặc chất làm tan giã thành tế bào. Nhiều enzym carbohydrases cũng được cho là thích họp để sử dụng trong trường hợp này như
Ilex aquifolium,
Vitìs vinifera, Humulus lupulus, Geranium sp...(Manen, J. F et al., 2005) [30]. Một phương pháp khác sử dụng hợp chất xanthateforming như sodium/potassium ethyl xanthogenate cũng đã được báo cáo trong trong vấn đề này. Những hợp chất này tạo nên
bào và phá hủy nó. Ngoài phá hủy thành tế bào, các tế bào thực vật cũng như mọi tế bào khác có thể phá hủy màng của chúng. Phương pháp này đặc biệt hữu dụng với những lá dai như lá lúa, có chứa lượng lớn cellulose, pectin, silica cells, chất sáp... (Williams, C. E
et al., 1994) [70]. Tuy nhiên, phương pháp này đã được đánh giá là cho số lượng ADN khá ít ...(Manen, J. F et al., 2005) [30].
1.2.5.2. Sự có mặt của các yếu tổ gây nhiễm
Vấn đề khó khăn thường gặp nhất ở hầu hết các quy trình là sự có mặt của các thành phần gây nhiễm ừong mẫu ADN, thường là các ARN, proteins, polysaccharides, polyphenolics và non-nuclear ADN. Các chất chuyển hóa thứ cấp cũng là yếu tố gây khó khăn có trong các tế bào thực vật, đặc biệt là khi sử dụng các nguồn cây dược liệu. Dưới đây là một số các yếu tố gây nhiễm.
Các Polysaccharide
Polysaccharides là mối quan tâm hàng đầu trong trong quy trình tách chiết ADN do chúng khó loại bỏ. Sự có mặt lượng lớn các polysaccharides trong các cây có độ nhầy cao như Sedum telephỉum (Barnwell, p et ah, 1998), [7], làm cho các mô homogenate rất nhầy, khiến biểu thị sai số lượng ADN có trong đó. Polysaccharides thường kết tủa cùng với ADN và cũng gây cản trở đối với sự hoạt động của các enzym như polymerases, ligases và enzym giới hạn endonucleases. Polysaccharides là chất gây nhiễm có thể gây ra những động lực học liên kết bất thường, và làm cho ADN khó có thể sử dụng cho những thí nghiệm sau. Các ADN bị nhiễm có xu hướng bám vào giếng trong khi điện di (Chakraborty, D et al., 2006) [9].
Sử dụng NaCl nồng độ cao (>0.5 M) cũng có thể loại bỏ Polysaccharides khỏi dung dịch chứa ADN đã được hòa tan bởi ethanol. Nồng độ của NaCl khác nhau tùy thuộc vào mỗi loài cây. Tác giả Zidani đã sử dụng NaCl 1.4M với cây kê (Pennisetum glaucum) (Zidani, s et al., 2005) [60]; Tác giả Aljanabi đã sử dụng NaCl 6M với cây lúa mì
(Triticum aestivum) và lúa mạch (Hordium vulgaris) có nhiều polysaccharide (Aljanabi, s. M et al., 1997) [4]. NaCl kết họp với các cation trong CTAB cũng đã cho thấy đc hiệu quả trong quy trình tách chiết đối với những cây giàu polysaccharide (Syamkumar, s et
al., 2003) [50]. CTAB giúp kết lắng ADN nhờ hình thành phức hợp trong môi trường nồng độ ion thấp, và nồng độ muối cao, hình thành phức chất không hòa tan cùng với protein và hàu hết axit polysaccharides, bỏ lại ADN trong dung dịch, sau đó có thể dễ dàng thu thập được ADN. Có những bộ phận ừên cây chứa quá nhiều polysaccharide, như ở củ, hạt polysaccharide dính với nhựa cũng có thể áp dụng được để loại bỏ các chất tạp nhiễm. Tác giả Rogstad đã sử dụng các enzym thủy phân như pectinase để phá hủy pectin như là một yếu tố gây nhiễm trong thực vật như Quercus rubra, Castanea dentate...{Rogstad, s. H et al., 2001) [44]. Một cách đơn giản và hiệu quả để giảm bớt chất gây nhiễm polysaccharide bằng cách sử dụng đệm tách chiết để rửa 2 hay 3 làn (Sharma, K. K et al., 2000) [47]. Các Polyphenol
Có lẽ vấn đề gặp phải thường xuyên ừong quy trình phân lập ADN thực vật làm giảm sản phẩm ADN thu được do sự có mặt của các Polyphenol. Các Polyphenol rất phức tạp và nhiều loại. Trong khi dung giải các tế bào, các Polyphenol cũng được giải phóng ra ngoài không bào và dễ dàng bị oxi hóa bởi oxidases của tế bào. Các Polyphenol bị oxi hóa có thể tương tác được với axit nucleic và gây nên sự vón cục cho ADN, do đó nó cản ừở rất nhiều trong quá trình tách chiết. Các Polyphenol như flavonoids, terpenoids and tannins, mà tất cả chúng đều chứa rất nhiều trong thực vật và không thể tách rời chúng khỏi axit nucleic bởi những quy trình tách chiết bình thường. Để giải quyết vấn đề của chất gây nhiễm Polyphenol, các chất chống oxi hóa được bổ sung vào dung dịch đệm tách chiết để ngăn chặn sự oxi hóa các phenol trong quá trình dung giải tế bào. Polyvinyl pyrollidone (PVP) và polyvinyl polypyrollidone (PVPP) là các chất hóa học thường được sử dụng nhất để loại trừ các Polyphenol, chúng hoạt động bằng cách liên kết và bám với các Polyphenol, đặc biệt là ở pH thấp. Chúng hình thành nên các phức chất với các hợp chất Polyphenol thông qua liên kết Hydro, làm cho các Polyphenol tách ra khỏi ADN, bằng cách đó sẽ làm giảm hàm lượng của chúng trong sản phẩm thu được. Mỗi họp chất hoặc cả hai họp chất đó có thể được sử dụng với một tỉ lệ thích hợp như đã được thử nghiệm bởi Basak (Basak, J et al., 2004) [6] với loài Vigna Mungoand Bambusa balcoa...
lắng với ADN, do đó chúng cũng như một chất làm nhiễm (Puchooa, D et al., 2004) [41]. Các chất chống oxi hóa như ß-mercaptoethanol, BSA, sodium azide, axit ascorbic, DTT, sodium sulfite, sodium iso-ascorbate, etc.,cũng như PVP thường được sử dụng để xử lí các vấn đề liên quan đến các phenolic, ß- Mercaptoethanol thường được sử dụng rộng rãi để ngăn chặn sự polyme hóa các tannin mà gây cản trở cho quá trình tách chiết mà gây ảnh hưởng tương tự như đối với các polysaccharide. Trong các cây có chứa nhiều polyphenol như cà chua, nho, Arabidopsis, canola, dừa, vv..., một chất ức chế sự oxi hóa polyphenol rất hiệu quả đó là DIECA cũng đã được công bố (Chen, D. H et al., 1999) [12], Permingeat đã sử dụng glucose như một chất để làm giảm sự tạp nhiễm bởi polyphenol trên đối tượng cây bông (Gossypium hirsutum).
Protein và ARN
Một lượng lớn protein và ARN có thể kết lắng với ADN. Phân tử ARN thường được loại trừ nhờ sử dụng Rnase; nếu cách này không phù hợp có thể dùng lithium chloride cũng cho hiệu quả tốt (Ahmad, s. M et al., 2004) [2]. Protein thường được loại bỏ bởi các hóa chất tách chiết như SDS, chloroform và chất kết tủa etanol sau khi dung giải nhân tế bào để thu ADN tinh sạch.
Chương 2. VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});