H t tí h khá g vi si h v t kiểm đị h đƣợc thực hiệ dựa trê hƣơ g há ha ã g đa ồ g độ. Đây à hƣơ g há thử h t tí h khá g vi si h v t kiểm đị h và ấm hằm đá h giá mức độ khá g khuẩ m h yếu của các mẫu thử thô g qua các giá trị thể hiệ h t tí h à MIC ( ồ g độ ức chế tối thiểu), IC50 ( ồ g độ ức chế 50%) và MBC ( ồ g độ diệt khuẩ tối thiểu).
3.3.3.1 Pha loãng mẫu thử
Mẫu ba đầu đƣợc ha ã g tr g DMSO và ƣớc cất vô trù g thà h một dãy 5 ồ g độ thích hợ the yêu cầu và mục đích thử. Nồ g độ thử ca hất à 128 g/mL, tiế the à 32 g/mL, 8 g/mL, 2 g/mL và 0,5 g/mL.
3.3.3.2 Thử hoạt tính
Chuẩ bị du g dịch vi khuẩ h ặc ấm với ồ g độ 5.105
CFU.mL khi tiế hà h thử.
Lấy 10 L du g dịch mẫu thử the các ồ g độ đã đƣợc ha ã g, thêm 200 L du g dịch vi khuẩ và ấm, ủ ở 37°C. Sau 24h, đọc giá trị MIC bằ g mắt thƣờ g. Giá trị MIC đƣợc xác đị h t i giế g có ồ g độ chất thử thấ hất gây ức chế h à t à sự hát triể của vi si h v t. Giá trị IC50 đƣợc tí h t á dựa trê số iệu đ độ đục tế bà bằ g máy qua g hổ TECAN và hầ mềm raw data.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Tổng hợp p-bromonitrobenzene (2) 4.1.1Kết quả tổng hợp chất 2
Hỗ hợ hả ứ g thu đƣợc ba đầu ba gồm một du g dịch tr g suốt và chất rắ màu và g h t khô g ta tr g ƣớc. Chất rắ ày đƣợc hòa ta tr g EA, chiết i với ƣớc và ƣớc muối bã hòa. Sắc ký bả mỏ g dịch chiết EA của sả hẩm thu đƣợc sau hả ứ g đƣợc trì h bày tr g Hì h 4.1. Từ trái qua hải ầ ƣợt à vết dịch chiết ƣớc, dịch chiết EA và dịch chiết muối bã hòa của hỗ hợ sả hẩm. Qua Hì h 4.1 ch thấy tr g dịch chiết EA thu đƣợc có hai vết ở Rƒ = 0,33 và Rƒ = 0,23. Hai vết ày à sả hẩm chất
2 và sả hẩm hụ à đồ g hâ vị trí của chất 2. Vì chất 2 có hai hóm thế ở
vị trí para với hau trê vò g be ze e, ít hâ cực hất tr g ba đồ g hâ vị trí ortho, meta và para-bromonitrobenzene ê dự đ á sả hẩm 2 à vết có Rƒ = 0,33.
Hì h 4.1 TLC dịch chiết sả hẩm hả ứ g tổ g hợ chất 2 (PE:EA=100:1). Dịch chiết EA đƣợc àm khô thu đƣợc sả hẩm thô. Sau đó, sả hẩm thô đƣợc kết ti h i tr g Ethanol 96° thu đƣợc sả hẩm ti h khiết, TLC sả hẩm ày ch một vết có Rƒ = 0,31 (hệ giải y PE) (Hì h 4.3). Cấu tr c của chất ày đƣợc xác đị h bằ g hƣơ g há hổ 1
H-NMR.
Xác định cấu trúc sản phẩm
Rf = 0,23 Rf = 0,33
Phổ 1 H-NMR δH (CDCl3, 500 MHz) (Phụ ục 1, Phụ ục 2): 8.11 ppm (2H, dd, J = 9 Hz và J = 2 Hz, CH be ze e) và 7.70 ppm (2H, dd, J = 2 Hz và J= 9 Hz, CH benzene). Bả g 4.1 Dữ iệu hổ 1 H-NMR của chất có Rƒ = 0,31 (PE:EA = 100:1). STT Số và i r t δ ( m) Mũi, J (Hz) 1 2H, CH (Benzene) 7,70 dd (J = 2 và J = 9) 2 2H, CH (Benzene) 8,11 dd (J = 9 và J = 2) Dữ iệu hổ 1
H-NMR hù hợ với cô g thức 1-bromo-4-nitrobenzene
(2), các r t đƣợc sắ xế hƣ sau: 1 2 2 1 Br NO2 Kết u chất tổ g hợ đƣợc có Rƒ = 0,31 (PE) à 1-bromo-4-nitrobenzene (2).
Chất 2 đƣợc cô ti h khiết bằ g hƣơ g há sắc ký cột và hƣơng
há kết ti h i và đƣợc sử dụ g ch các giai đ sau.
Phƣơ g há sắc ký cột: Sả hẩm thô đƣợc tách bằ g sắc ký cột với silica gel ha thƣờ g, hệ giải y à PE:EA = 100:1
Kết quả sắc ký cột đƣợc thể hiệ tr g Hì h 4.2 ch thấy từ ọ 7 đế ọ 9 chỉ có chất 2, từ ọ 10 đế ọ 13 à sả hẩm hụ, và tất cả các ọ cò i thì khô g thấy có chất à xuất hiệ .
Hì h 4.2 TLC sắc ký cột (PE:EA = 100:1) và chất 2 ti h chế bằ g sắc ký cột. Phƣơ g há kết ti h i: Sả hẩm thô đƣợc kết ti h i tr g du g môi etha 96%, ti h thể thu đƣợc có d g hì h kim, màu trắ g (Hì h 4.3).
(a) (b)
Hì h 4.3 Ti h thể (a) và TLC (PE) sả hẩm chất 2 ti h chế bằ g kết ti h i, Rƒ = 0,31 (b).
Nhằm tìm ra điều kiệ tốt hất tổ g hợ chất 2, các hả ứ g khả sát
các điều kiệ ả h hƣở g đế hả ứ g itr hóa hƣ: hiệt độ hả ứ g, thời gian hả ứ g và tỉ ệ m HNO3/chất 1 đƣợc tiế tục tiế hà h ghiê cứu. Vì tác chất 1 à hợ chất dễ bay hơi và sả hẩm t thà h à chất rắ ít ta tr g dịch ƣớc acid gây khó khă ch việc the dõi hả ứ g bằ g TLC, ê ở mỗi hả ứ g đƣợc khả sát, kết quả hả ứ g sẽ đƣợc kiểm tra bằ g dịch chiết hả ứ g sau khi hả ứ g đã kết th c. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.1.2Khảo sát điều kiện tổng hợp chất 2 4.1.2.1 Khảo sát nhiệt độ phản ứng 4.1.2.1 Khảo sát nhiệt độ phản ứng
Kết quả TLC (PE:EA = 100:1) khả sát hiệt độ hả ứ g tổ g hợ chất
2 đƣợc trì h bày ở Hì h 4.4, từ trái qua hải ầ ƣợt à TLC khả sát hả
ứ g ở các hiệt độ 45°C, 55°C, 65°C. Từ kết quả TLC ch thấy, khi hả ứ g đƣợc thực hiệ ở cả ba hiệt độ đều ch hai sả hẩm ta đƣợc tr g EA (một sả hẩm chí h và một sả hẩm hụ). Kết hợ với kết quả hiệu suất hả ứ g ở Bả g 4.2, h xét rằ g hiệu suất hả ứ g tổ g hợ chất 2 bị ả h hƣở g rất ớ bởi hiệt độ hả ứ g, hiệt độ quá ca hay quá thấ đều khô g ch hiệu suất tốt. Phả ứ g xảy ra ở hiệt độ 55°C ch hiệu suất hả ứ g cao hất ê hả ứ g itr hóa ê thực hiệ ở hiệt độ ày à hù hợ hất.
Bả g 4.2 Kết quả khả sát hiệt độ hả ứ g tổ g hợ chất 2. Nhiệt độ (°C) Bromobenzene (mg) HNO3 (mg) H2SO4 (mg) Khối ƣợ g sả hẩm (mg) Hiệu suất (%) 45 50,8 103,0 108,0 21,0 32,10 55 56,9 94,4 95,6 26,3 35,88 65 52,1 106,0 111,0 14,9 22,23
4.1.2.2 Khảo sát thời gian phản ứng
Kết quả TLC khả sát thời gia hả ứ g đƣợc trì h bày tr g Hì h 4.5, từ trái qua hải ầ ƣợt à TLC hả ứ g tổ g hợ với các thời gia ầ ƣợt à 10 h t, 15 h t, 20 h t, 25 h t và 30 h t. Từ kết quả TLC ch thấy ở tất cả các thời gia khả sát, dịch chiết sả hẩm hả ứ g đều ch hai sả hẩm. Kết hợ với số iệu tr g Bả g 4.3, r t ra h xét rằ g thời gia có ả h hƣở g đế hiệu suất hả ứ g. Hiệu suất hả ứ g ca hất thu đƣợc khi hả ứ g đƣợc thực hiệ tr g thời gia 20 h t (43,82%). Từ đó r t ra kết u , thời gia tốt hất để thực hiệ hả ứ g itr hóa tổ g hợ chất 2 à 20 h t. Bả g 4.3 Kết quả khả sát thời gia hả ứ g tổ g hợ chất 2.
Thời gia ( h t) Bromobenzene (mg) HNO3 (mg) H2SO4 (mg) Khối ƣợ g sả hẩm (mg) Hiệu suất (%) 10 247,2 530,0 555,0 136,5 42,92 55 208,0 408,0 421,3 102,5 38,3 20 194,6 385,6 390,6 109,8 43,82 25 196,7 392,8 405,5 102,8 40,62 30 212,0 418,9 430,7 68,1 24,97
4.1.2.3 Khảo sát tỉ lệ mol HNO3/Chất 1
Tỉ ệ m HNO3/chất 1 the hƣơ g trì h hả ứ g hải à 1. Tuy hiê , từ số iệu hiệu suất hả ứ g tổ g hợ đƣợc trì h bày tr g Bả g 4.4 ch thấy tỉ ệ m giữa chất 1 và HNO3 à 1:1 thì ch hiệu suất rất thấ (7,64%). Ngƣợc i, khi tỉ ệ HNO3 ca hơ thì hiệu suất hả ứ g thu đƣợc ca hơ . Hiệu suất thu đƣợc ca hất à khi tỉ ệ HNO3/chất 1 à 6:1 (59,27 %). Từ đó đƣa ra kết u , tỉ ệ HNO3/chất 1 cũ g ả h hƣở g đế hiệu suất hả ứ g. Để hả ứ g
itr hóa tổ g hợ chất 2 xảy ra tốt hất thì tỉ ệ HNO3/chất 1 ê bằ g 6. Bả g 4.4 Số iệu khả sát tỉ ệ m HNO3/chất 1 hả ứ g tổ g hợ chất 2. Tỉ ệ mol Bromobenzene (mg) HNO3 (mg) H2SO4 (mg) Khối ƣợ g sả hẩm (mg) Hiệu suất (%) 1:1 183,0 122,5 128,6 18,0 7,64 1:2 181,4 232,7 240,6 85,7 36,72 1:3 184,7 355,1 352,6 82,2 34,59 1:4 182,0 466,9 475,4 121,9 52,06 1:5 181,8 592,4 600,1 123,7 53,03 1:6 180,3 695,9 708,4 137,5 59,27 1:7 191,4 875,3 879,0 94,5 38,37 1:8 180,7 946,6 955,7 112,3 48,30
4.1.2.4 Kết luận điều kiện tổng hợp chất 2
Các điều kiệ tổ g hợ chất 2 đƣợc tóm tắt tr g Bả g 4.5. Bả g 4.5 Điều kiệ tốt hất tổ g hợ chất 2.
Các yếu tố Giá trị
Nhiệt độ phản ứ g (°C) 55
Thời gian phản ứ g ( h t) 20
Tỉ lệ mol bromobenzene : acid nitric 1:6
Tốc độ khuấy (vò g/ h t) 500
4.2 Tổng hợp 2-chloro-(4-nitrophenoxy)benzene (3) 4.2.1Tổng hợp chất 3 4.2.1Tổng hợp chất 3
Bả mỏ g sắc ký sả hẩm thu đƣợc đƣợc trì h bày ở Hì h 4.6. Từ trái sa g hải the thứ tự ầ ƣợt à các vết: 2-chlorophenol, hỗ hợ KOH và 2-chlorophenol ha tr g DMSO, hỗ hợ sả hẩm và chất 2. Bả mỏ g ch thấy tr g hỗ hợ sả hẩm khô g cò vết của chất 2 (Rƒ = 0,62), cò vết của hỗ hợ KOH và 2-chlorophenol (Rƒ = 0,30) đồ g thời xuất hiệ vết mới khá đ m có Rƒ = 0,47 (PE:EA = 10:1). Hì h 4.6 TLC (PE:EA=10:1) hả ứ g tổ g hợ chất 3. Cấu tr c của chất có Rƒ = 0,47 đƣợc các đị h bằ g hổ 1H-NMR. Xác định cấu trúc sản phẩm Phổ 1 H-NMR δH (CDCl3, 500 MHz) (Phụ ục 3, Phụ ục 4): 8,21 ppm (dt, J = 9 Hz và J = 3,5 Hz); 7,52 ppm (dd, J = 8 Hz và J = 1,5 Hz); 7,36 ppm (m, J = 7,5 Hz và J = 1,5 Hz); 7,26 ppm (m, J = 8 Hz và J = 1,5 Hz); 7,17 ppm (dd, J = 8 Hz và J = 1,5 Hz); 6,96 ppm (dt, J = 9,5 Hz và J = 3,5 Hz). Bả g 4.6 Dữ iệu hổ của chất 3. STT Số và i r t (ppm) Mũi, J (Hz) 1 1H, CH 7,52 dd, J = 8 Hz và J = 1,5 Hz 2 1H, CH 7,26 m, J = 8 Hz và J = 1,5 Hz 3 1H, CH 7,36 m, J = 7,5 Hz và J = 1,5 Hz 4 1H, CH 7,17 dd, J = 8 Hz và J = 1,5 Hz 5 2H, CH 6,96 dt, J = 9,5 Hz và J = 3,5 Hz 6 2H, CH 8,21 dt, J = 9 Hz và J = 3,5 Hz Rƒ = 0,62 Rƒ = 0,47 Rƒ = 0,30
Dữ iệu hổ 1 H-NMR (Bả g 4.6) hù hợ với cô g thức 2-chloro-(4-nitrophenoxy)benzene (3), các r t đƣợc sắ xế hƣ sau: O Cl NO2 6 5 4 3 2 1 5 6 Kết quả kết ti h i sả hẩm thô:
Chất 3 đƣợc cô ti h khiết bằ g hƣơ g há kết ti h i tr g du g dịch etha 96%. Ti h thể chất 3 có hì h khối đa giác, tr g suốt khô g màu. Kết quả TLC (PE:EA=10:1) sả hẩm kết ti h i thu đƣợc một vết có Rƒ=0,47 (Hì h 4.7).
(a) (b)
Hì h 4.7 Ti h thể chất 3 (a) và TLC sả hẩm (PE:EA=10:1) (b) ti h chế bằ g kết ti h i tr g etha 96%.
4.2.2 Khảo sát điều kiện tổng hợp chất 3 4.2.2.1 Khảo sát nhiệt độ phản ứng 4.2.2.1 Khảo sát nhiệt độ phản ứng
Các yếu tố cố đị h:
Tỉ ệ m KOH/o-C6H4ClOH/chất 2 = 1,5/1,5/1. Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t.
Thời gia hả ứ g 2 giờ.
Yếu tố thay đổi: Phả ứ g đƣợc thực hiệ ở ba hiệt độ khác hau 80°C, 100°C và 120°C.
TLC khả sát hiệt độ hả ứ g tổ g hợ chất 3 đƣợc trì h bày ở Hì h (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.8. Từ trái qua hải à TLC của ba hả ứ g với ba hiệt độ 80°C, 100°C và 120°C. Qua bả mỏ g ch thấy khi thực hiệ hả ứ g ở hiệt độ thấ (80°C),
hả ứ g chƣa tốt d xảy ra chƣa h à t à , vết chất 2 vẫ cò ; ở hiệt độ ca (120°C), hả ứ g xảy ra tuy h à t à hƣ g i si h ra sả hẩm hụ, xuất hiệ vết sả hẩm hụ ở Rƒ = 0,07; t i 100°C, hả ứ g xảy ra h à t à và si h ra ít sả hẩm hụ. Từ đây r t ra h xét hiệt độ có ả h hƣở g đế hả ứ g, hiệt độ hả ứ g cà g ca , thời gia hả ứ g cà g ha h hƣ g cà g dễ si h ra sả hẩm hụ. 100°C à hiệt độ ch kết quả hả ứ g tốt hất.
Hì h 4.8 TLC khả sát hiệt độ hả ứ g tổ g hợ chất 3 (PE:EA=10:1).
4.2.2.2 Khảo sát thời gian phản ứng
Các yếu tố cố đị h:
Tỉ ệ m KOH/o-C6H4ClOH/chất 2 = 1,5/1,5/1. Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t.
Nhiệt độ hả ứ g 100°C.
Yếu tố thay đổi: Phả ứ g đƣợc the dõi bằ g TLC hỗ hợ sả hẩm hả ứ g ở các thời gia 1 giờ, 1 giờ 30 h t, 2 giờ, 2 giờ 30 h t và 3 giờ.
TLC khả sát thời gia hả ứ g tổ g hợ chất 3 đƣợc trì h bày ở Hì h 4.9. Từ trái qua hải à TLC của hả ứ g t i 5 thời điểm: 1 giờ, 1 giờ 30 h t, 2 giờ, 2 giờ 30 h t và 3 giờ. Qua bả mỏ g sắc ký ch thấy, hả ứ g xảy ra khá ha h, hả ứ g xảy ra h à t à tr g thời gia 1 giờ đế 1 giờ 30 h t, t i thời điểm 1 giờ 30 h t, hỗ hợ hả ứ g khô g cò vết tác chất
2; thời gia hả ứ g cà g ké dài, hả ứ g cũ g khô g si h thêm sả hẩm
hụ à (khô g có thêm vết hụ t i thời điểm từ 2 giờ đế 3 giờ). Từ đây r t ra h xét, sau khi hả ứ g xảy ra h à t à , thời gia hả ứ g cà g âu hơ cũ g khô g ả h hƣở g đế hiệu suất hả ứ g. Thời gia thực hiệ hả ứ g tốt hất à 1 giờ 30 h t.
Hì h 4.9 TLC khả sát thời gia hả ứ g tổ g hợ chất 3 (PE:EA=10:1).
4.2.2.3 Khảo sát tỉ lệ mol KOH/chất 2
Các yếu tố cố đị h:
Nhiệt độ hả ứ g 100°C.
Thời gia hả ứ g 1 giờ 30 h t. Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t.
Tỉ ệ m o-C6H4ClOH/chất 2 = 1,5/1.
Yếu tố thay đổi: Các hả ứ g đƣợc thực hiệ với các tỉ ệ m KOH/chất 2 à 1; 1,5; 2 và 2,5.
TLC khả sát tỉ ệ m KOH/chất 2 hả ứ g tổ g hợ chất 3 đƣợc trì h bày ở Hì h 4.10. Từ trái qua hải à TLC của 4 hả ứ g với 4 tỉ ệ m KOH/chất 2 ầ ƣợt à 1; 1,5; 2 và 2,5. Qua bả mỏ g ch thấy, ở tỉ ệ 1:1, ƣợ g KOH quá ít khô g đủ ch hả ứ g xảy ra đƣợc h à t à , tr g hỗ hợ sả hẩm cò vết tác chất 2 khá đ m; ở các tỉ ệ ớ hơ 1,5:1 2:1 và
2,5:1, hả ứ g xảy ra ha h hơ ê hỗ hợ sả hẩm khô g cò vết tác chất 2. Tuy hiê , ở hai tỉ ệ 2:1 và 2,5:1, sả hẩm xuất hiệ vết sả hẩm
phụ khá rõ (vết hụ t i đƣờ g xuất hát và vết hụ có Rƒ = 0,07). Từ đây r t ra h xét, tỉ ệ KOH có ả h hƣở g rất hiều đế hiệu suất hả ứ g, ƣợ g KOH cà g hiều thì cà g xuất hiệ hiều sả hẩm hụ àm giảm hiệu suất hả ứ g. Lƣợ g KOH tốt hất ch hả ứ g à 1,5 m KOH ch mỗi mol chất 2.
4.2.2.4 Khảo sát tỉ lệ mol o-C6H4ClOH/chất 2
Các yếu tố cố đị h:
Nhiệt độ hả ứ g 100°C.
Thời gia hả ứ g 1 giờ 30 h t. Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t. Tỉ ệ m KOH/chất 2 = 1,5/1.
Yếu tố thay đổi: Phả ứ g đƣợc thực hiệ với tỉ ệ m
o-C6H4ClOH/chất 2 ầ ƣợt à 1; 1,3; 1,4; 1,5; 1,7 và 2.
TLC khả sát tỉ ệ m o-C6H4ClOH/chất 2 hả ứ g tổ g hợ chất 3
đƣợc trì h bày ở Hì h 4.11. Từ trái qua hải à TLC của 7 hả ứ g tƣơ g
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});