3.1.1Thiết bị và dụng cụ
Hệ thố g đu h à ƣu. Máy khuấy từ gia hiệt. Cá từ. Câ điệ tử. Phễu chiết 250 mL. Bộ cô quay ố g đứ g EYELA N10. Cột sắc ký, ố g ma quả . Cốc thủy tinh 100 mL, 250 mL, 500 mL. Giấy ọc, giấy đ H. Pi et thủy ti h i 1 mL, 5 mL, 10 mL. Ố g đ g 10 mL, 25 mL, 50 mL, 100 mL.
Bì h cầu đáy trò 10 mL, 50 mL. Bì h quả ê 250 mL. Bả mỏ g sắc ký si ica ge 60 F254, Merck. 3.1.2 Hóa chất Bromobenzene (Merck). 2-Chlorophenol (Merck). sắt. Acid nitric đ m đặc. Acid sulfuric đ m đặc. Acid hydrochloride đ m đặc.
Petroleum ether (Chemsol). Ethyl acetate (Chemsol). Kali hydroxide (Trung Quốc).
Natri hydroxide (Trung Quốc).
Natri chloride (Trung Quốc).
Natri sulfate khan (Trung Quốc).
Dimethyl sulfoxide DMSO (Tru g Quốc).
Etha 96° (Việt Nam). Etha tuyệt đối.
Nƣớc cất.
Thuốc thử Ni hydri . Silica gel (Merck). Methanol (Chemsol).
3.2 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.2.1Tổng hợp p-bromonitrobenzene (2) 3.2.1.1 Điều kiện sơ bộ tổng hợp chất 2
Chất 2 đƣợc tổ g hợ từ chất 1 bằ g hả ứ g itr hóa, x c tác acid
sulfuric và acid nitric đ m đặc the hả ứ g đƣợc trì h bày tr g Hì h 3.1.
Br Br NO2 HNO3/H2SO4 50 - 600C, 20m 1 2 Bromobenzene 1-Bromo-4-nitrobenzene Hì h 3.1 Phả ứ g tổ g hợ chất 2. Cơ chế hả ứ g đƣợc trì h bày hƣ Hì h 3.2.
OH NO2 + H2SO4 H O NO2 H H O NO2 H H2O + NO2+ NO2+ NO2 + H3O+ 1-Bromo-4-nitrobenzene Br Br NO2 H OH2 Br
Hì h 3.2 Cơ chế hả ứ g itr hóa tổ g hợ chất 2. Cách thực hiệ hả ứ g hƣ sau:
HNO3 đ m đặc (695,9 mg; 6,85 mmol) đƣợc ch và bì h cầu 50 mL. Sau đó, H2SO4 đ m đặc (708,4 mg; 7,08 mmol) đƣợc thêm từ từ và HNO3, hỗ hợ đƣợc để guội đế hiệt độ hò g. Tiế the , từ g giọt chất 1
(180,3 mg; 1,15 mmol) đƣợc thêm và hỗ hợ acid một cách th t ch m, vừa cho và vừa ắc đều, ếu hỗ hợ bị ó g hải àm h gay dƣới vòi ƣớc. Sau khi ƣợ g chất 1 đƣợc ch và hết thì hỗ hợ đƣợc đu ở hiệt độ 55°C và khuấy 500 vò g/ h t trê bế từ. Sau 20 h t, gƣ g hả ứ g, hỗ hợ đƣợc àm guội đế hiệt độ hò g. Hỗ hợ sả hẩm đƣợc hòa ta tr g du g môi Ethyl acetate (EA) và đƣợc chiết i với ƣớc và ƣớc muối bã hòa 3 ầ , mỗi ầ 10 mL. Sả hẩm thô đƣợc kết ti h i trong ethanol 96% thu đƣợc chất 2 ti h khiết. Sả hẩm đƣợc kiểm tra bằ g TLC, hệ giải y
PE:EA = 100:1.
3.2.1.2 Khảo sát điều kiện phản ứng tổng hợp chất 2 a. Khảo sát nhiệt độ phản ứng
Các yếu tố cố đị h:
Tỉ ệ m chất 1/HNO3 = 1. Thời gia hả ứ g 20 h t. Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t.
Yếu tố thay đổi: Các hả ứ g đƣợc thực hiệ ở ba hiệt độ khác hau 45°C, 55°C, 65°C.
b. Khảo sát thời gian phản ứng
Các yếu tố cố đị h:
Tỉ ệ m chất 1/HNO3 = 1. Nhiệt độ hả ứ g 55°C.
Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t.
Yếu tố thay đổi: Các hả ứ g đƣợc kết th c ở các thời gia ầ ƣợt à 10 h t, 15 h t, 20 h t, 25 h t, 30 h t.
c. Khảo sát tỉ lệ mol HNO3/chất 1
Các yếu tố cố đị h:
Nhiệt độ hả ứ g 55°C. Thời gia hả ứ g 20 h t. Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t.
Yếu tố thay đổi: Các hả ứ g đƣợc thực hiệ ở các tỉ ệ m HNO3/chất
1 ầ ƣợt à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.
3.2.2Tổng hợp 2-chloro-(4-nitrophenoxy)benzene (3) 3.2.2.1 Điều kiện sơ bộ tổng hợp chất 3
Chất 3 đƣợc tổ g hợ từ chất 2 và 2-chlorophenol và KOH. Phƣơ g trì h hả ứ g hƣ Hì h 3.3. Br NO2 Cl HO O Cl O2N 1000C, 3h 2 3 1-Bromo-4-nitrobenzene 2-Chloro-(4-nitrophenoxy)benzene
Hì h 3.3 Phả ứ g tổ g hợ chất 3 the hƣơ g há SNAr. Cơ chế hả ứ g đƣợc trì h bày tr g Hì h 3.4. O OH H Cl O Br NO2 Cl O NO2 Br Cl O NO2 Br Cl O NO2 Cl Hì h 3.4 Cơ chế hả ứ g tổ g hợ chất 3.
Cách tiế hà h hả ứ g đƣợc trì h bày hƣ sau:
KOH (0,420 mg; 7,5 mm ) đƣợc ch và bì h cầu đáy trò 50 mL và đƣợc hòa ta với 0,25 mL ƣớc cất. Sau đó, DMSO (10 mL) đƣợc thêm và , hỗ hợ đƣợc khuấy đều sa ch KOH đƣợc hâ tá đều tr g DMSO. Sau đó, 2-chlorophenol (0,963 mg; 7,5 mmol) đƣợc thêm tiế và hỗ hợ và khuấy đều. Chất 2 (1,008 g; 5 mm ) tiế tục đƣợc thêm và hỗ hợ . Hỗ
hợ đƣợc đu ó g ở 100°C và khuấy ở tốc độ 500 vò g/ h t. Sau 90 h t, gừ g hả ứ g, hỗ hợ sả hẩm đƣợc hòa ta tr g 50 mL EA. Dịch EA của sả hẩm đƣợc chiết 3 ầ với ƣớc, mỗi ầ 50 mL, chiết 3 ầ với ƣớc muối bã hòa, mỗi ầ 50 mL. Dịch chiết EA đƣợc àm kha bằ g Na2SO4, sau đó cô quay thu hồi du g môi thu đƣợc sả hẩm thô. Sả hẩm thô đƣợc kết ti h i với etha 96% thu đƣợc chất 3 ti h khiết.
3.2.2.2 Khảo sát điều kiện phản ứng tổng hợp chất 3 a. Khảo sát nhiệt độ phản ứng
Các yếu tố cố đị h:
Tỉ ệ m KOH/o-C6H4ClOH/chất 2 = 1,5/1,5/1. Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t.
Thời gia hả ứ g 2 giờ.
Yếu tố thay đổi: Phả ứ g đƣợc thực hiệ ở 3 hiệt độ khác hau 80°C, 100°C và 120°C.
b. Khảo sát thời gian phản ứng
Các yếu tố cố đị h:
Tỉ ệ m KOH/o-C6H4ClOH/chất 2 = 1,5/1,5/1. Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t.
Nhiệt độ hả ứ g 100°C.
Yếu tố thay đổi: Phả ứ g đƣợc the dõi bằ g TLC (PE:EA=10:1) hỗ hợ sả hẩm hả ứ g ở các thời gia 1 giờ, 1 giờ 30 h t, 2 giờ, 2 giờ 30 h t và 3 giờ.
c. Khảo sát tỉ lệ mol KOH/chất 2
Các yếu tố cố đị h:
Nhiệt độ hả ứ g 100°C.
Thời gia hả ứ g 1 giờ 30 h t. Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t.
Yếu tố thay đổi: Các hả ứ g đƣợc thực hiệ với các tỉ ệ m KOH/chất 2 à 1; 1,5; 2; 2,5.
d. Khảo sát tỉ lệ mol o-chlorophenol/chất 2
Các yếu tố cố đị h:
Nhiệt độ hả ứ g 100°C.
Thời gia hả ứ g 1 giờ 30 h t. Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t. Tỉ ệ m KOH/chất 2 = 1,5/1.
Yếu tố thay đổi: Phả ứ g đƣợc thực hiệ với tỉ ệ m o-C6H4C OH/chất
2 à 1; 1,3; 1,4; 1,5; 1,7 và 2.
3.2.3Tổng hợp 4-(2-chlorophenoxy)aniline (4) 3.2.3.1 Điều kiện sơ bộ tổng hợp chất 4
Phả ứ g tổ g hợ chất 4 đƣợc thực hiệ bằ g hƣơ g há khử Becham từ chất 3 đƣợc trì h bày tr g Hì h 3.5. O H2N Cl O Cl O2N 3 4 Fe/HCl 30m, 1000C 2-Chloro-(4-nitrophenoxy)benzene 4-(2-Chlorophenoxy)aniline Hì h 3.5 Phả ứ g tổ g hợ chất 4. Cơ chế hả ứ g hƣ Hì h 3.6.
N O O R N OH O R H Fe N OH O R Fe N OH O R 2H N OH2 OH R R N OH Fe R N OH Fe R N OH +2H R N OH2 H Fe R N H Fe R N H H RNH2 R = Cl O Hì h 3.6 Cơ chế hả ứ g hợ chất 4.
Phả ứ g tổ g hợ chất 4 đƣợc tiế hà h the hai hƣơ g há sau:
Phương pháp 1: Chất 3 (249,5 mg; 1 mmol) đƣợc hòa ta tr g 50 mL
EtOH 99,5°. Tiế the , bột sắt (1,008 g; 18 mm ) đƣợc thêm và du g dịch trê . Hỗ hợ đƣợc đu h à ƣu trê bế khuấy từ ở hiệt độ 100°C và tốc độ khuấy 500 vò g/ h t. Sau 5 h t, du g dịch HC 4,23% (1 mL) đƣợc thêm tiế và hỗ hợ hả ứ g. Ngƣ g hả ứ g sau 30 h t. Hỗ hợ hả ứ g sau khi kết th c đƣợc thêm và 0,5 g NaOH rắ rồi đƣợc hòa ta tr g 50 mL EA (gọi dịch EA ày à dịch EA1). Dịch EA1 đƣợc ọc rửa hiều ầ qua giấy ọc để i bỏ cặ rắ , sau đó đƣợc chiết i hiều ầ với HC 1% đế khi khô g cò chất 4 tr g dịch EA1. Dịch acid vừa chiết x g đƣợc tru g hòa
với KOH đế khi thu đƣợc du g dịch có H bằ g 7 rồi đƣợc chiết tiế với EA thu đƣợc dịch chiết EA2. Cô quay thu hồi du g môi dịch chiết EA2 thu đƣợc sả hẩm thô. Sả hẩm thô đƣợc kết ti h i tr g du g dịch MeOH:H2O (95:5) thu đƣợc chất 4 ti h khiết.
Phương pháp 2: EtOH 99,5° (50 mL) đƣợc h t bằ g i et và ch và
bì h cầu đáy trò 100 mL. Bột sắt (1,008 g; 18 mmol) đƣợc câ chí h xác và thêm và du g dịch EtOH trê . Tiế theo, du g dịch HC 4,23% (1 mL) đƣợc thêm tiế và hỗ hợ hả ứ g. Hỗ hợ hả ứ g đƣợc ắ và hệ thố g đu h à ƣu, gia hiệt ở 100°C và đƣợc khuấy ở tốc độ 500 vò g/ h t kh ả g 15 h t ch hết bọt khí. Khi hỗ hợ hết bọt khí, chất 3 (249,5 mg; 1 mmol) đƣợc ch tiế và bì h cầu. Hỗ hợ tiế tục đƣợc gia hiệt và khuấy
tiế thêm 15 h t rồi gừ g hả ứ g. Hỗ hợ hả ứ g sau khi kết th c đƣợc thêm và 0,5 g NaOH rắ rồi đƣợc hòa ta tr g 50 mL EA (gọi dịch EA ày à dịch EA1). Dịch EA1 đƣợc ọc rửa hiều ầ qua giấy ọc để i bỏ cặ rắ , sau đó đƣợc chiết i hiều ầ với HC 1% đế khi khô g cò chất 4
tr g dịch EA1. Dịch acid vừa chiết x g đƣợc tru g hòa với KOH đế khi thu đƣợc du g dịch có H bằ g 7 rồi đƣợc chiết tiế với EA thu đƣợc dịch chiết EA2. Cô quay thu hồi du g môi dịch chiết EA2 thu đƣợc sả hẩm thô. Sả hẩm thô đƣợc kết ti h i tr g du g dịch MeOH:H2O (95:5) thu đƣợc chất 4 ti h khiết.
3.2.3.2 Khảo sát điều kiện phản ứng tổng hợp chất 4
Các hả ứ g khả sát đƣợc thực hiệ the hƣơ g há 2.
a. Khảo sát nhiệt độ phản ứng
Yếu tố cố đị h:
Thời gia hả ứ g 15 h t. Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t.
Tỉ ệ đƣơ g ƣợ g Fe/chất 3 (eq) = 5. EtOH/HCl 4,23% (mL) = 5/1.
Yếu tố thay đổi: Phả ứ g tổ g hợ chất 4 đƣợc thực hiệ ở các hiệt độ
ầ ƣợt à 50°C, 70°C, 100°C, 120°C và 150°C.
b. Khảo sát thời gian phản ứng
Yếu tố cố đị h:
Nhiệt độ hả ứ g 100°C. Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t.
Tỉ ệ đƣơ g ƣợ g Fe/chất 3 (eq) = 5. EtOH/HCl 4,23% (mL) = 5/1.
Yếu tố thay đổi: Phả ứ g đƣợc khả sát bằ g TLC (PE:EA=7:3) t i các thời điểm hả ứ g 15 h t, 30 h t, 45 h t và 60 h t.
c. Khảo sát tỉ lệ đƣơng lƣợng Fe/chất 3
Yếu tố cố đị h:
Nhiệt độ hả ứ g 100°C. Thời gia hả ứ g 15 h t. Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t. EtOH/HCl 4,23% (mL) = 5/1.
Yếu tố thay đổi: Các hả ứ g đƣợc thực hiệ ở các tỉ ệ đƣơ g ƣợ g Fe/chất 3 (eq) ầ ƣợt à 2, 3, 4, 5 và 6. d. Khảo sát nồng độ HCl Yếu tố cố đị h: Nhiệt độ hả ứ g 100°C. Thời gia hả ứ g 15 h t. Tốc độ khuấy 500 vò g/ h t. Tỉ ệ đƣơ g ƣợ g Fe/chất 3 = 5. EtOH/HCl (mL) = 5/1.
Yếu tố thay đổi: Các hả ứ g đƣợc thực hiệ ở các ồ g độ du g dịch HCl ầ ƣợt hƣ sau: 4,23%, 2,12%, 8,46%. e. Khảo sát tốc độ khuấy Yếu tố cố đị h: Nhiệt độ hả ứ g 100°C. Thời gia hả ứ g 15 h t. EtOH/HCl 4,23% (mL) = 5/1. Tỉ ệ đƣơ g ƣợ g Fe/chất 3 = 5.
Yếu tố thay đổi: Phả ứ g đƣợc thực hiệ ở các tốc độ khuấy hƣ sau 300 vò g/ h t, 500 vò g/ h t, 800 vò g/ h t, 1200 vò g/ h t.
3.3 PHƢƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG SINH[22,23]
Các mẫu thử đƣợc thử ghiệm h t tí h khá g khuẩ , khá g ấm trê 7 dò g vi si h v t, thực hiệ t i Phò g thử h t tí h si h học, Việ Hóa học, Việ Hà âm Kh a học và Cô g ghệ Việt Nam.
3.3.1Các chủng vi sinh vật thử nghiệm
Ba gồm hữ g vi khuẩ và ấm kiểm đị h gây bệ h ở gƣời d ATCC cu g cấ :
Bacillus subtilis (ATCC 6633): à trực khuẩ gram (+), si h bà tử,
thƣờ g khô g gây bệ h.
Staphylococcus aureus (ATCC 13709): cầu khuẩ gram (+), gây mủ
các vết thƣơ g, vết bỏ g, gây viêm họ g, hiễm trù g có mủ trê da và các cơ qua ội t g.
Escherichia coli (ATCC 25922): gram (-), gây một số bệ h về đƣờ g
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): gram (-), trực khuẩ mủ
xa h, gây hiễm trù g huyết, các hiễm trù g ở da và iêm m c, gây viêm đƣờ g tiết iệu, viêm mà g ã , mà g tr g tim, viêm ruột.
Candida albicans (ATCC 10231): à ấm me , thƣờ g gây bệ h tƣa
ƣỡi ở trẻ em và các bệ h hụ kh a.
Lactobacillus fermentum (L B14): gram (+), à i vi khuẩ đƣờ g
ruột ê me có ích, thƣờ g có mặt tr g hệ tiêu hóa của gƣời và độ g v t. Enterococcus faecium (B650): gram (+), vi khuẩ gây bệ h viêm
đƣờ g tiết iệu, viêm ruột thừa, viêm mà g tr g tim, viêm mà g ã .
3.3.2Môi trƣờng nuôi cấy
MHB (Mueller – Hinton Broth), MHA (Muller – Hinton Agar); TSB (Try tic S y Br th), TSA (Try tic S y Agar) ch vi khuẩ ; SAB, SA ch ấm.
3.3.3Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
H t tí h khá g vi si h v t kiểm đị h đƣợc thực hiệ dựa trê hƣơ g há ha ã g đa ồ g độ. Đây à hƣơ g há thử h t tí h khá g vi si h v t kiểm đị h và ấm hằm đá h giá mức độ khá g khuẩ m h yếu của các mẫu thử thô g qua các giá trị thể hiệ h t tí h à MIC ( ồ g độ ức chế tối thiểu), IC50 ( ồ g độ ức chế 50%) và MBC ( ồ g độ diệt khuẩ tối thiểu).
3.3.3.1 Pha loãng mẫu thử
Mẫu ba đầu đƣợc ha ã g tr g DMSO và ƣớc cất vô trù g thà h một dãy 5 ồ g độ thích hợ the yêu cầu và mục đích thử. Nồ g độ thử ca hất à 128 g/mL, tiế the à 32 g/mL, 8 g/mL, 2 g/mL và 0,5 g/mL.
3.3.3.2 Thử hoạt tính
Chuẩ bị du g dịch vi khuẩ h ặc ấm với ồ g độ 5.105
CFU.mL khi tiế hà h thử.
Lấy 10 L du g dịch mẫu thử the các ồ g độ đã đƣợc ha ã g, thêm 200 L du g dịch vi khuẩ và ấm, ủ ở 37°C. Sau 24h, đọc giá trị MIC bằ g mắt thƣờ g. Giá trị MIC đƣợc xác đị h t i giế g có ồ g độ chất thử thấ hất gây ức chế h à t à sự hát triể của vi si h v t. Giá trị IC50 đƣợc tí h t á dựa trê số iệu đ độ đục tế bà bằ g máy qua g hổ TECAN và hầ mềm raw data.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Tổng hợp p-bromonitrobenzene (2) 4.1.1Kết quả tổng hợp chất 2
Hỗ hợ hả ứ g thu đƣợc ba đầu ba gồm một du g dịch tr g suốt và chất rắ màu và g h t khô g ta tr g ƣớc. Chất rắ ày đƣợc hòa ta tr g EA, chiết i với ƣớc và ƣớc muối bã hòa. Sắc ký bả mỏ g dịch