Trong quá trình tiến hành thí nghiệm và phân tích mẫu, thí nghiệm đã tiến hành phân tích sáu loại vi sinh vật theo Tiêu chuẩn Việt Nam.
Số chỉ tiêu vi sinh vật trên một mẫu vật: trong thí nghiệm đã tiến hành phân tích 6 chỉ tiêu vi sinh vật: vi sinh vật hiếu khí, Coliforms, E.coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium perfringens.
3.3.4.1 Quy trình phân tích tổng số vi sinh vật hiếu khí
Định lượng vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đếm tất cả các khuẩn lạc mọc trên môi trường dinh dưỡng NA theo Tiêu chuẩn Việt Nam năm 1990 (TCVN: 1990).
a) Cách tiến hành: chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, cấy chuyển 0,1 ml
dung dịch mẫu vào môi trường NA (2 đĩa cho mỗi nồng độ pha loãng), dùng que thuỷ tinh dàn mẫu cho khô và trải đều trên mặt thạch, đem ủ ấm ở 37o
C trong 24 giờ.
b) Đọc kết quả: đếm tất cả các khuẩn lạc mọc trên mặt thạch, chọn những đĩa
có từ 25-300 khuẩn lạc đọc kết quả.
c) Công thức tính vi sinh vật hiếu khí:
Trong đó:
X: tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong 1 g mẫu thử C: Tổng số khuẩn lạc có trên tất cả các đĩa
n1: Số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ nhất đếm được n2: Số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ hai đếm được d: Hệ số pha loãng đếm được
m: Lượng mẫu cấy
d m n n C X ( 10,1 2)
3.3.4.2 Quy trình phân tích Coliforms
Định lượng Coliforms tổng số bằng phương pháp đếm khuẩn lạc điển hình và không điển hình trên môi trường VGBL, theo Tiêu chuẩn Việt Nam 6848:2007
a) Cách tiến hành: chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp cấy chuyển 0,1 ml vào
môi trường VGBL (2 đĩa cho mỗi nồng độ pha loãng), dùng que thuỷ tinh vô trùng dàn mẫu cho khô và đều mặt thạch, đem ủ ở 37oC trong 24 giờ.
b) Kết quả: chọn đĩa petri có từ 10 đến 150 khuẩn lạc để đếm. Khuẩn lạc có
màu đỏ ánh tía có đường kính 0,5 mm hoặc lớn hơn (đôi khi có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh), các khuẩn lạc này không cần khẳng định sinh hoá. Chọn 5 không điển hình (khuẩn lạc mờ đục, nhạt màu hơi lầy nhầy) cho vào ống nghiệm chứa ống sinh hơi và môi trường BGBL rồi đem ủ ở 37oc trong 24 giờ, phản ứng dương tính khi mô trường BGBL chuyển sang đục và có hơi khí chiếm ba phần tư ống Duham’s.
c) Công thức tính kết quả Coliforms:
Mẫu pha loãng
Môi trường NA
Dàn mẫu cho đều mặt thạch
Ghi nhận tất khuẩn lạc
ủ 37oC, 24 giờ
Sơ đồ 3.1: Quy trình phân tích vi sinh vật hiếu khí
Trong đó:
C: Tổng số khuẩn lạc trên các đĩa ở các nồng độ (số khuẩn lạc trên mỗi đĩa 25). V: Thể tích mẫu cấy trên một đĩa
n1: Số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ nhất n2: Số đĩa ở nồng độ pha loãng thứ hai d: Nồng độ pha loãng tương ứng thứ nhất R: Tỉ số khẳng định (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
R N V(n10,C1n2)d
3.3.4.3 Quy trình phân tích vi khuẩn E.coli
Định lượng vi khuẩn E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc điển hình trên môi trường TBX theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN: 2008).
a) Cách tiến hành: Chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, cấy chuyển 0,1 ml
dung dịch mẫu phân tích vào môi trường TBX (2 đĩa cho mỗi độ pha loãng), dùng que thuỷ tinh vô trùng dàn mẫu cho khô và trải đều trên toàn bộ mặt thạch rồi đem ủ ở 37o
C, trong 24 giờ.
b) Đọc kết quả: khuẩn lạc E.coli điển hình có màu xanh muối mật, đếm những đĩa có ít hơn 150 khuẩn lạc điển hình và ít hơn 300 khuẩn lạc (điển hình và không điển hình).
c) Công thức tính kết quả E.coli:
Trong đó:
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được
ni: Số đĩa có khuẩn lạc được chọn
v: Dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa
fi: Nồng độ pha loãng có số khuẩn lạc tại các đĩa đếm được R: Tỉ lệ khẳng định
R g
CFU
A( / ) n1vf1N...nivfi
Mẫu pha loãng
Môi trường VRBL
Dàn mẫu cho đều trên mặt thạch
Đọc kết quả
Chọn 5 khuẩn lạc không điển hình
Khẳng định sinh hóa
(môi trường VGBL đục, sinh khí trong ống Duham’s)
Ủ 37oC, 24 giờ
3.3.4.4 Quy trình phân tich vi khuẩn Staphylococcus aureus
Định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường Baird Parker theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN-5156:1990).
a) Cách tiến hành: sử dụng máy lắc đồng nhất mẫu, chọn 2 nồng độ pha
loãng liên tiếp thích hợp rồi dùng micropipette vô trùng rút 0,1 ml mẫu thử cho vào đĩa petri chứa môi trường Baird Parker dùng que thuỷ tinh vô trùng dàn mẫu cho khô và trĩa đều trên mặt thạch, đem ủ ở 37o
C trong 24-48 giờ.
b) Đọc kết quả: khuẩn lạc Staphylococcus aureus điển hình mọc trên môi trường Baird Parker có màu đen hoặc xám, bóng và lồi được bao quanh bởi một vùng trong rõ rệt cũng có thể mờ từng phần. Chọn 5 khuẩn lạc điển hình để thử sinh hóa: phản ứng catalase dương tính, phản ứng đông huyết dương tinh, phản ứng dùng huyết dương tính. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
c) Cách tính kết quả:
Mẫu pha loãng
Môi trường TBX
Dàn mẫu trải đều mặt thạch
Đọc kết quả (khuẩn lạc có màu xanh muối mật)
Ủ 37oC, 24 giờ
Sơ đồ 3.3: Quy trình phân tích E.coli
Trong đó:
n: số khuẩn lạc đếm được
A: tỉ lệ cho kết quả đong huyết tương và dung huyết m: Nồng độ pha loãng
d: khối lượng mẫu cấy
d m A n g CFU M( / )
3.3.4.5 Quy trình phân tích vi khuẩn Salmonella
Định tính Salmonella theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN-5153:1990). Việc định tính Salmonella được thực hiện qua 4 công đoạn sau: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định.
a) Mẫu thịt
Tăng sinh: cân 25 g mẫu thịt vào túi nylon vô trùng có chứa 225 ml dung dịch đệm peptone, đem ủ ở 37o
C trong 24 giờ.
ủ 37o
C, 24 giờ
Mẫu pha loãng
Dàn mẫu cho đều mặt thạch Môi trường BP
Ghi nhận khuẩn lạc điển hình
Môi trường BHI
Ghi nhận khuẩn lạc không điển hình ủ 37oC, 24 giờ Chọn 5 khuẩn lạc Thử đông huyết tương(+) Thử phản ứng dung huyết(+) Thử phản ứng catalaza (+) Môi trường BHI
Chọn 5 khuẩn lạc
ủ 37o
C, 24 giờ
Tăng sinh chọn lọc: sử dụng micropipette vô trùng rút 1ml mẫu tăng sinh cho vào túi nylon chứa 9 ml môi trường RVS. Tương tự cũng cấy chuyển 1 ml dung dịch tăng sinh vào 9 ml môi trường MKTTn, đem tất cả chúng ủ ở 37o
C trong khoảng 18-24 giờ.
Phân lập: dùng que cấy vòng vô trùng cấy mẫu tăng sinh chọn lọc vào môi trường BGA và XLD, đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khẳng định: khuẩn lạc Salmonella nghi ngờ trên môi trường BGA có vòng tròn màu hồng, bóng loáng và hơi lồi, khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD là những khuẩn lạc có tâm đen, xung quanh tâm hơi trong không màu. Chọn 5 khuẩn lạc điển hình cấy chuyển tiếp vào môi trường NA rồi đem ủ trong 24 giờ ở 37oC.
Thử sinh hóa Salmonella dương tính khi: thạch urea âm tính (thạch urea không đổi màu), Citrate dương tính (môi trường chuyển sang màu hồng), VP âm tính (khi không có xuất hiện vòng sáng màu hồng đến màu đỏ sáng trong khoảng 15 phút), Indol âm tính (khi xuất hiện một vòng màu nâu vàng trong ống nghiệm), cấy ria trên mặt thạch TSI dương tính (có màu vàng).
b) Mẫu swab
Cho các mẫu swab vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch đệm peptone đã được vô trùng rồi đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. Các thao tác phân tích còn lại tương tự như mẫu phân tích đối với thịt tươi.
Môi trường XLD
Mẫu
Khẳng định sinh hóa
Môi trường BGA
Tăng sinh chọn lọc trong môi trường KMTTn Tăng sinh không chọn lọc trong
pepton
Ghi nhân khuẩn lạc điển hình
Tăng sinh chọn lọc trong môi trường RVS
Môi trường BGA Môi trường XLD
Chọn 5 khuẩn lạc điển hình ủ 37oC, 24 giờ ủ 37oC, 24 giờ ủ 37oC, 24 giờ urea (-), citrate(+), VP(-), indol(-)
3.3.4.6 Quy trình phân tích vi khuẩn Clostridium perfringens
Quy trình phân tích vi khuẩn Clostridium perfringens dựa vào sự định tính sự hiện diện của chúng trên mẫu phân tích theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN- 4991:2005).
a) Cách tiến hành: dùng micropipette vô trùng cấy chuyển 1 ml mẫu thử vào
môi trường chứa 10-15 ml thạch SC chuẩn bị sẵn ở nhiệt độ 44-45oC rồi lắc nhẹ cho đều mẫu phân tích sau đó để nguội, tiếp tục đổ thêm 10 ml thạch SC rồi để nguội. Đem ủ trong bình kị khí ở 37o
C trong 24 giờ.
b) Đọc kết quả: khuẩn lạc điển hình có kết tủa màu đen, do khử sunfite thành
sunfua làm cho khuẩn lạc bị đen. Chọn 5 khuẩn lạc ở những đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc, cấy từng khuẩn lạc vào môi trường thioglycholate lỏng rồi đem ủ ở 37o
C trong điều kiện kị khí (18-24 giờ). Sau khi ủ, dùng micropipette vô trùng chuyển 5 giọt dung dịch cấy vào môi trường LS, ủ trong điều kiện kị khí ở 46o
C trong 18-24 giờ trong nồi cách thủy. Kiểm tra môi trường LS có màu đen và xuất hiện bọt khí chiếm một phần tư ống nghiệm và có kết tủa màu đen được xem là dương tính.