KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ VÀ PHÁT HIỆN ĐỘT

GEN katG LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC ISONIAZID Ở CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO NGHIÊN CỨU

Đoạn gen KatG của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu sau khi đọc trình tự được xử lý kết quả qua phần mềm tin sinh học BioEdit. So sánh trình tự nucleotide và acid amin từ các mẫu nghiên cứu với trình tự nucleotide và acid amin của chủng dại H37Rv chúng tôi thu được kết quả xuất hiện các đột biến khác nhau trên các chủng lao kháng thuốc. Kết quả được thể hiện qua hình 3.8 và 3.9

Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

Hình 3.8: So sánh trình tự nucleotide từ các mẫu nghiên cứu với trình tự nucleotide của chủng dại H37Rv

Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

Từ hình 3.8 chúng tôi nhận thấy:

Đột biến xảy ra ở 10 mẫu trên tổng số 12 mẫu nghiên cứu. Đột biến có thể xảy ra ở một điểm hoặc nhiều điểm trên đoạn gen katG quan tâm.

Mỗi acid amin có thể được mã hóa bởi nhiều bộ ba. Vì vậy không phải tất cả các đột biến đều dẫn đến sự hình thành một acid amin mới. Các đột biến làm xuất hiện bộ ba mã hóa mới, nhưng không dẫn đến sự hình thành acid amin mới thì không làm thay đổi cấu trúc bậc một của protein, do đó cấu trúc không gian của protein vẫn được giữ vững nên các đột biến này không liên quan tới tính kháng thuốc.

Hình 3.9: So sánh trình tự acid amin các mẫu nghiên cứu với trình tự acid amin của chủng dại H37Rv

Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

Từ hình 3.9 chúng tôi nhận thấy:

Sự đột biến xảy ra ít nhất trên 1 codon và nhiều nhất là trên 3 codon như ở các mẫu nghiên cứu S8 và S10.

Trong số 10 mẫu nghiên cứu có mang đột biến thì có tới 5 mẫu có đột biến tại codon 315, chiếm 50%. Đột biến tại codon 315 này là đột biến thay thế 1 nucleotide loại G thành loại C, sự thay thế này làm bộ ba AGC trở thành ACC. Sự thay đổi bộ ba mã hóa các acid amin kéo theo là sự thay đổi các acid amin do bộ ba đó quy định. Vì vậy acid amin tại codon 315 được biến đổi từ serine thành threonine. Năm 2001, Abate và cộng sự đã giải trình tự gen katG

của 68 chủng vi khuẩn lao kháng INH được phân lập từ châu Âu, kết quả thu được 62 mẫu (91%) có đột biến tại codon 315 AGC→ACC (S315T), 4 mẫu (6%) có đột biến AGC→ACC (S315T) và 2 mẫu (3%) có đột biến AGC→ACA (S315T) [12]. Các đột biến hiếm xảy ra khác (AGC→ATC [S315I] và AGC→CGC [S315R]) cũng đã được tìm thấy trong các nghiên cứu đối với các chủng vi khuẩn lao được phân lập từ châu Phi [29]. Năm 2008, Gonul Aslan và cộng sự đã tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm tại nhiều vùng khác nhau tại Châu Á để xác định các đột biến liên quan đến tính kháng thuốc trên các gen katG, inhA, rpoB. Tác giả đã tiến hành nghiên cứu 30 mẫu. Trong đó các mẫu được chẩn đoán có liên quan đến tính kháng isoniazid là 25 mẫu. Tiến hành đọc trình tự tác giả thu được 4 điểm đột biến trên gen katG. Tại codon 315 có các dạng đột biến: S315T, S315N, S315I, trong đó dạng đột biến S315T chiếm tỷ lệ lớn, chiếm 72% [18]. Trong nghiên cứu của chúng tôi chỉ gặp một dạng đột biến ở codon 315 làm biến đổi acid amin Serine thành Threonine, dạng đột biến S315T cũng chiếm tỷ lệ rất cao, chiếm 50%. Dạng đột biến S315I và S315Nchúng tôi không gặp, có thể là do số lượng mẫu của chúng tôi còn hạn chế, hoặc đây có thể là dạng đột biến đặc trưng cho từng vùng địa lý. Như vậy, các mẫu lao kháng thuốc được thu thập từ nhiều nơi trên thế giới có đặc điểm chung đó là xảy ra đột biến tại codon 315 với dạng đột biến điển hình là S315T với một tần suất rất cao, bên cạnh đó là đột biến

Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

S315I, S315N và S315R với tần suất nhỏ hơn. Như vậy, nghiên cứu của chúng tôi hoàn toàn thống nhất với các công bố trong và ngoài nước. Ngoài ra, Dalla Costa và cộng sự [16] cũng chỉ ra rằng, ngoài đột biến S315T là đột biến phổ biến liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid thì vẫn tồn tại các đột biến khác như tại điểm 258 có đột biến G258D. Gonul Aslan và cộng sự [18] khi nghiên cứu về xác định đột biến liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid cũng cho thấy, ngoài codon 315 là đột biến chính thì vẫn tồn tại các đột biến tại các codon khác, tác giả tìm thấy 2 đột biến khác đó là G279T và A293T. Tuy nhiên, cả hai công bố trên không đưa ra được những chứng cứ về đột biến tại các điểm này có liên quan tới tính kháng thuốc. Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi phát hiện ra một số điểm đột biến mới, các đột biến này chưa từng được công bố trước đây. Ở mẫu nghiên cứu S8 và S10, phát hiện đột biến tại rất nhiều vị trí (47 và 48 vị trí trên đoạn gen katG). Ở mẫu S3, phát hiện thêm các đột biến tại codon 223 và 238, dạng V223A và N238I. Ở mẫu S4, phát hiện đột biến, tại codon 263 là A263T. Ở mẫu S13, phát hiện đột biến tại codon 199, dạng G199V. Ở mẫu S14, phát hiện đột biến, tại codon 304 là Y304H. Ở mẫu S15, phát hiện đột biến tại codon 225 là M225V. Với số lượng mẫu hạn chế và chưa có điều kiện phân tích sâu về protein nên chúng tôi chưa khẳng định được các đột biến này có liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid. Có thể đột biến này là các đột biến mới phát sinh không ảnh hưởng tới tính kháng thuốc, hoặc cũng có thể các đột biến này có liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid ở một mức độ nhất định. Để có thể đưa ra một kết luận chính xác về tính kháng thuốc của các mẫu bệnh phẩm này cần phải tiến hành trên một số lượng mẫu lớn hơn và các mẫu được thu thập ở nhiều nơi khác nhau trên thế giới để nghiên cứu.

Riêng ở mẫu S6 không thấy có sự đột biến trên codon nào của đoạn gen

katG nghiên cứu, nhưng theo chẩn đoán kháng sinh đồ thì mẫu S6 kháng 4 loại thuốc dòng một (HSRE) và kháng 5 loại thuốc dòng hai (Ofx, Th, Eto, Km và PAS), như vậy gen katG của mẫu S6 có thể mang đột biến tại codon

Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

ngoài vùng gen mà chúng tôi nghiên cứu. Vùng gen chúng tôi nghiên cứu là vùng hay xảy ra đột biến liên quan tới tính kháng thuốc. Tuy nhiên, bên cạnh vùng gen hay xảy ra đột biến này thì vẫn có những điểm đột biến khác có liên quan tới tính kháng thuốc.

Đồng thời với những mẫu nghiên cứu cho kết quả kháng sinh đồ siêu kháng trên, chúng tôi cũng tiến hành giải trình tự đoạn gen katG của mẫu N1 là mẫu nhạy cảm với kháng sinh chống lao. Kết quả cho thấy, mẫu N1 không xuất hiện đột biến nào trên đoạn gen katG mà chúng tôi nghiên cứu.

Từ các dẫn chứng trên, chúng tôi có cơ sở vững chắc hơn để có thể khẳng định nghiên cứu của chúng tôi là hoàn toàn chính xác và thống nhất với các công bố của các tác giả trong và ngoài nước.

Tóm lại, qua nghiên cứu 11 mẫu bệnh phẩm có mang đột biến liên quan tới tính kháng thuốc ở các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid chúng tôi thấy rằng tỷ lệ đột biến trên gen katG là gần 91%. Tại các mẫu nghiên cứu có đột biến thì đột biến S315T chiếm tỷ lệ cao là 50%. Các kết quả nghiên cứu này của chúng tôi là thống nhất với nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới. Đồng thời các kết quả đó cũng chỉ ra rằng việc ứng dụng sinh học phân tử nghiên cứu cấu trúc gen katG vi khuẩn lao của chúng tôi đã bước đầu thành công và hoàn toàn có thể ứng dụng giải trình tự gen này để chẩn đoán vi khuẩn lao kháng isoniazid ở Việt Nam. Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc bằng phương pháp giải trình tự gen sẽ rút ngắn thời gian xuống còn khoảng 4 - 7 ngày thay vì từ 2 - 4 tháng như phương pháp kinh điển trước đây. Vấn đề này có ý nghĩa rất lớn với công tác điều trị và kiểm soát bệnh lao ở một nước có mức độ bệnh nhân lao cao như nước ta.

Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận

1.1. Nhân bản thành công gen katG từ các chủng vi khuẩn lao

Thực hiện phản ứng PCR nhân bản thành công đoạn gen katG ở 12/12 chủng vi khuẩn lao nghiên cứu.

Đã thực hiện tách dòng, tạo vector tái tổ hợp, tách chiết và thu được DNA plasmid có chứa đoạn gen katG đủ tiêu chuẩn phục vụ giải trình tự gen.

1.2. Đột biến trên gene katG liên quan đến tính kháng isoniazid ở vi khuẩn lao

Tỷ lệ đột biến gen katG ở 11 chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid là 10/11 (gần 91%).

Trong 10 chủng vi khuẩn lao có mang đột biến thì dạng đột biến thay thế một nucleotide tại codon 315, làm sai nghĩa dịch mã dẫn tới thay đổi một acid amin, chiếm tỷ lệ cao 50%. Có một số chủng mang nhiều đột biến thay thế ở các codon khác nhau.

Ngoài dạng đột biến S315T phổ biến trên thế giới, còn phát hiện các đột biến tại các điểm khác chưa từng được công bố.

2. Kiến nghị

Cần nghiên cứu với số lượng chủng vi khuẩn lao lớn hơn để có thể đánh giá chính xác hơn nữa tỷ lệ, vị trí, và tương quan kháng thuốc của các đột biến có thể xảy ra trên gen katG.

Khuyến cáo các cơ sở trong nước sử dụng sinh học phân tử để rút ngắn thời gian chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc.

Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1. Bộ Y tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2006), Báo cáo tổng kết Chương trình chống lao quốc gia 2005

2. Bộ y tế, Viện Thông tin Thư viện Y học trung ương (2007), tình hình bệnh lao

3. Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu sự đáp ứng miễn dịch trong một số thể bệnh lao, luận án tiến sỹ sinh học

4. Lê Thị Luyến, Bộ y tế (2007), Tình hình dịch tễ, điều trị, dự phòng và nghiên cứu Lao tại Việt Nam, Hội thảo sinh học phân tử về bệnh lao, Đại học Quốc gia Hà Nội, tháng 8/2007

5. Nguyễn Đình Bảng (1992) vi sinh vật y học, Học viện Quân Y

6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo dục.

7. Nguyễn Văn Hưng(2001), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của: Mycobacterium tuberculosis phân lập tại bệnh viện lao và bệnh phổi, Luận án tiến sỹ Y học

8. Phùng Công Thưởng (2007), Nghiên Cứu chẩn đoán Vi khuẩn lao kháng Rifapicin bằng phương pháp xác định đột biến trên gene ropB, Luận văn thạc sỹ y học.

9. Quyền Đình Thi (2005), Công nghệ sinh học, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật

10.Thuốc – sức khỏe (2009), Thuốc chống lao

11.Trần Văn Sáng (1999) Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng và điều trị, Nhà xuất bản giáo dục

Tiếng Anh

12.Abate, G., S. E. Hoffner, V. O. Thomsen, and H. Miorner. 2001.

Characterization of isoniazid-resistant strains of Mycobacterium

Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

tuberculosis on the basis of phenotypic properties and mutations in katG. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20:329-333

13. Ahmad S, Fares E, Araj GF, Chugh TD, Mustafa AS (2002),

Prevalence of S315T mutation within the katG gene in isoniazid-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Dubai and Beirut. Inter J Tuber and lung dis 6(10):920-926

14. Amina A (2009), Genotypic detection of rifampicin and isoniazid

resistant Mycobacterium tuberculosis strains by DNA sequencing: a randomized trial. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 8:4

15. Aslan G, Tezcan S, Serin MS, Emekdas G (2009), Genotypic analysis of isoniazid and rifampin resistance in drug-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis complex isolates in southern Turkey,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18653964?

ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPa nel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum

16. Dalla Costa and et al (2009), Correlations of mutations in katG, oxyR- ahpC and inhA genes and in vitro susceptibility in Mycobacterium tuberculosis clinical strains segregated by spoligotype families from tuberculosis prevalent countries in South America

17. García de V, Infantes S D, Lasala F, Chaves F, Alcala L, Bouza E

(2002), New real-time PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and high-level isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol 40:988-995

18. Gonul Aslan and et al (2008), Genotypic analysis of isoniazid and rifampicin resistance in drug-resistant clinical mycobacterium tuberculosis complex isolates in southern tukey

19. http://bioweb.uwlax.edu/bio203/s2007/millard_ashl/diagnosis.htm

Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 20. http://feww.wordpress.com/2008/10/08/climate-change-spreads-deadly- dozen-diseases/ 21. http://vi.wikipedia/wiki/cochedocluccuavikhuan 22. http://www.indiastudychannel.com/resources/67560-Prevention- Treatment-for-tuberculosis-World-Tuberculosis-Day.aspx

23. Jeremy W. Dale et al (1999) Molecular Epidemiology of tuberculosis

in Malaysia, Journal ò Clinical Microbiology, Vol.37, No.5,p. 1265-1268

24. Juan carlos Palomino, Sylvia Cardoso Leão, Viviana Ritacco (2007)

Tuberculosis 2007 - from basic science to patient care, http://www.tuberculosisTexbook.com

25. Kristin Kremer, Margreta van Zetten et al(1997) 26. S.H.E Kaufmann, H.Hahn, Mycrobacteria and TB

27. WHO (2007), Fact sheet N0104 Revised March 2007, Tuberculosis,

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/

28. WHO(2000), anti- Tuberculosis drug resistance in the world, report

No.2. WHO/TB/2000

29.Wu X, Zhang J, Hu Z (2009), Study on the mutations of ahpC genes in M. tuberculosis isoniazid-resistant isolates, 1998 Dec; 21(12):727-9.

Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU...4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...6

1.1.GIỚI THIỆU VỀ BỆNH LAO...6

1.1.Tình hình bệnh lao trên thế giới ...6

1.2.Tình hình bệnh lao ở Việt Nam...7

1.3.Tình hình lao kháng thuốc...9

1.2. VI KHUẨN LAO...11

1.2.1. Cấu tạo của vi khuẩn lao và cơ chế gây bệnh...11

1.2.2. Đặc điểm hệ gen của vi khuẩn lao ...14

1.3. CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN LAO ...14

1.3.1. Các loại thuốc kháng sinh được dùng trong điều trị lao...14

1.3.2. Các nguyên nhân gây kháng thuốc của vi khuẩn lao...15

1.3.3. Cơ chế kháng thuốc isoniazid của vi khuẩn lao...15

1.3.4. Các phương pháp chẩn đoán lao kháng thuốc...16

1.3.2. Phương pháp chẩn đoán vi lao kháng isoniazid...18

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...19

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...19

2.2. VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU ...19

2.2.1. Các sinh phẩm hóa chất chính ...19

2.2.2. Các máy và thiết bị chính (Bảng 2.3)...21

2.2.3. Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu...21

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...22

2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu ...22

2.3.2. Các kỹ thuật chính dùng trong nghiên cứu ...22

2.3.3. Kỹ thuật tách dòng (cloning), tạo sản phẩm phục vụ giải trình tự gen katG...24

Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học

2.3.4. Phương pháp đọc trình tự DNA trên máy đọc trình tự tự động và

phân tích kết quả bằng các phần mềm chuyên dụng...27

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN...28

3.1. KẾT QUẢ NHÂN GEN katG TỪ CÁC CHỦNG LAO KHÁNG THUỐC ...28

3.2. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG GEN katG...29

3.2.1 Kết quả tinh sạch DNA...29

3.2.2 Phản ứng gắn đoạn gen đích katG vào vector tách dòng pBT...31

3.2.3 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli khả biến DH5α...31

3.2.4 Kết quả kiểm tra đoạn gen katG trong biến nạp bằng phản ứng clony PCR...33

3.2.5 Tách plasmid...34

3.2.6 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn...35

3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ VÀ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN katG LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC ISONIAZID Ở CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAO NGHIÊN CỨU ...36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...42

TÀI LIỆU THAM KHẢO...43