DH5α
Sau khi đoạn gen katG đã được gắn vào vector pBT, để làm gia tăng số lượng bản sao của vector tái tổ hợp này một cách nhanh chóng, chúng tôi tiến hành biến nạp plasmid tái tổ hợp vào trong tế bào khả biến E.coli DH5α và nuôi cấy lắc trên môi trường LB lỏng ở 370C trong 1 giờ để làm phục hồi tế bào E.coli mang plasmid tái tổ hợp đó. Sản phẩm biến nạp sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicillin 50
Đỗ Thị Phương 31 K13.0605 C ác v ị tr í c ắt cu ̉a e nz ym e g iơ ́i h ạn
Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
µg/ml, X-gal 20 mg/ml và IPTG 100 mM và được nuôi tĩnh ở 370C trong 18h. Kết quả biến nạpđược trình bày ở hình 3.4
Hình 3.4: Chọn dòng khuẩn mang plasmid tái tổ hợp trên môi trường LB có bổ
sung carbenicillin 50 µg/ml, X-gal 20 mg/ml và IPTG 100 mM.
Sau 18h nuôi cấy, trên môi trường LB thạch có chứa kháng sinh carbenicillin, X-gal và IPTG, xuất hiện hai loại khuẩn lạc: khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng. Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đã được biến nạp plasmid chứa gen kháng kháng sinh carbenicillin, tuy nhiên chỉ có những khuẩn lạc màu trắng là mang plasmid tái tổ hợp. Vì những vi khuẩn
E. coli chứa plasmid pBT nguyên vẹn sẽ có gen lacZ hoàn chỉnh sản xuất ra β- galactosidase. Enzyme này phân hủy cơ chất X-gal có trong môi trường tạo nên dẫn xuất indol, dẫn xuất này ngoài môi trường sẽ bị oxy hóa tạo thành màu xanh. Nếu có đoạn DNA ngoại lai xen vào giữa gen lacZ thì gen này sẽ bị phá hỏng, enzyme β-galactosidase không được tạo ra, vì thế mặc dù có X- gal trong môi trường nhưng cơ chất này không bị thủy phân, không tạo nên dẫn xuất indol và khuẩn lạc có màu trắng.
Tuy nhiên những khuẩn lạc màu trắng chưa chắc chắn là chứa plasimid tái tổ hợp với đoạn DNA quan tâm, trong trường hợp này có thể do plasmid gắn với một đoạn DNA lạ khác nhiễm vào hoặc plasmid không được biến nạp vào trong tế bào. Do đó, để có kết quả chính xác các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ
Khoá luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học
hợp chứa đoạn gen katG chúng tôi tiến hành sàng lọc khuẩn lạc bằng kỹ thuật clony – PCR.