Tảo đƣợc ứng dụng rộng rãi và rất nhiều trên thế giới và là nguồn thực phẩm giàu chất dinh dƣỡng mang lại giá trị kinh tế cao, đã đƣợc ứng dụng trên quy mô công nghiệp với nhiều sản phẩm đƣợc chiết xuất từ tảo phục vụ trong nhiều lĩnh vực nhƣ: Trong y học, công nghệ mỹ phẩm, công nghệ thực phẩm, làm phân bón, sử dụng nhƣ hóa chất... và đặc biệt là trong nuôi trồng thủy sản nó có thể làm thức ăn cho các ấu trùng tôm, nhuyễn thể...mặt khác có thể đánh giá chất lƣợng nƣớc. Pernambuco (2012) đã sử dụng tính nhạy cảm của Thalassiosira fluviatilis để đánh giá mức độ nhiễm độc nƣớc tại cảng Suape (Brazil) và Kali Dicromat.
-17-
Còn theo Parslow et al. (1984) và Thompson (1999) loài Thallasiosira pseudonana thƣờng đƣợc nuôi để làm thức ăn cho động vật không xƣơng sống biển giai đoạn ấu trùng...
-18-
Chƣơng III
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm
Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm thức ăn tự nhiên, Khoa Thủy Sản, Trƣờng Đại Học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
Nguồn tảo: Tảo Thalassiosira sp. có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm của Viện nghiên cứu thủy sản 2 và đƣợc giữ giống tại phòng thí nghiệm Nuôi thức ăn tự nhiên, Bộ môn thủy sinh học ứng dụng, Khoa Thủy Sản, Trƣờng Đại Học Cần Thơ. Tảo đƣợc nuôi dƣỡng lƣu trữ trong dung dịch Walne, nồng độ muối 25ppt, nhiệt độ 25o
C.
Nƣớc ngọt đƣợc cung cấp từ nhà máy nƣớc Cần Thơ.
Nƣớc ót từ Vĩnh Châu, pha loãng có độ mặn 25ppt đƣợc xử lý bằng chlorine (20ppm) và sục khí liên tục trong thời gian 12-24 giờ và trung hòa bằng dung dịch Thiosunlfate natri (Na2S2O3) nếu còn chlorine dƣ.
Bình tam giác 1lít (18 cái), nhiệt kế thủy ngân (1 cái), máy đo ánh sáng, máy đo pH, chai 110ml (thu mẫu kiểm tra môi trƣờng), đèn huỳnh quang 1,2 m, hệ thống sục khí, tủ lạnh bảo quản mẫu môi trƣờng, hóa chất (formol 4% cố định mẫu tảo), cồn 700.
-19-
3.3 Bố trí thí nghiệm 3.3.1 Thí nghiệm 1 3.3.1 Thí nghiệm 1
Ảnh hƣởng của các môi trƣờng lên sự phát triển của tảo Thalassiosira sp.
Thí nghiệm đƣợc bố trí khối ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại. NT1: Môi trƣờng Walne (1970) NT2: Môi trƣờng Ukeles NT3: Môi trƣờng Ben-Amozt (1987) NT4: Môi trƣờng Guillard f/2 (1975) NT5: Môi trƣờng Algal-l NT6: Môi trƣờng phân N:P:K
Thí nghiệm đƣợc bố trí trong phòng ở nhiệt độ 250C. Tảo đƣợc cấy giống trong bình tam giác thể tích 1lít, độ mặn 25ppt, ánh sáng phía trƣớc bình tam giác 2700-3400 lux, với mật độ cấy ban đầu 3x105 tb/ml, dinh dƣỡng bằng dung dịch Walne (Coutteu, 1996)
Dinh dƣỡng: từ môi trƣờng nuôi khác nhau tƣơng ứng với từng nghiệm thức đƣợc dinh dƣỡng một lần duy nhất vào ngày đầu tiên bố trí thí nghiệm. Ánh sáng đƣợc duy trì bằng đèn huỳnh quang với thời gian chiếu sáng và sục khí liên tục .
Hằng ngày theo dõi thể tích nƣớc nuôi, trong trƣờng hợp nƣớc mất đi do quá trình bay hơi thì bổ sung bằng nƣớc cất. Theo dõi sự phát triển của tảo.
Thí nghiệm sẽ kết thúc khi mật độ tảo Thalassiosira sp. ở các nghiệm thức bắt đầu giảm 2 ngày liên tục.
-20-
Bảng 3.1 Thành phần dinh dƣỡng của các môi trƣờng
Guillard
(f/2) Ukeles
Ben–
Amozt Algal-l Walne
Thành phần các chất Lƣợng (mg/l) NaNO3 75.0004 170.0000 425.0000 239.0625 100 NaH2PO4.2H2O 5.6613 15.5899 31.2000 21.1355 20 FeCl3.6H2O 3.1581 4.4971 0.9439 8.6222 1.3 ZnCl2 0.0094 0.1364 4.7914 0.1940 0.021 MnCl2.4H20 0.1778 0.1979 1.9764 0.2772 0.36 (NH4)6.Mo7O24.4H2O 0.0317 1.2240 6.1186 1.2500 0.009 CoCl2.6H2O 0.0120 0.0240 0.0714 0.0323 0.02 CuSO4.5H2O 0.0099 0.0249 0.0745 0.0332 0.02 EDTA - - - - 45.0 H3BO3 - - - - 33.6 Thiamine HCl 0.1 0.035 0.035 0.028 0.2 Biotin 0.0005 0.005 0.005 0.0014 - Cyanocobalamin 0.0005 0.003 0.003 0.0014 0.1
Hàm lƣợng dinh dƣỡng của phân đa dinh dƣỡng N:P:K 16:16:8 gồm có: Đạm (N) 16%; lân (P2O5) 16%; Kali (K2O) 8%; Canxi (Cao) 10%; Magiê (MgO) 6%; Silíc (SiO2) 10% các nguyên tố vi lƣợng: B, Zn, Mn, Cu, Co, ...
Đạm Phú Mỹ với các thành phần dinh dƣỡng chủ yếu: Nito 46,3 %; Biurét 1%. Môi trƣờng N:P:K là sự kết hợp giữa:
Phân N:P:K (16:16:8): 30mg/l Phân Ure:15(mg/l. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(Theo Palanisamy et al., 1991 trích bởi Coutteau, 1996) Các yếu tố theo dõi mục 3.4.
-21-
3.3.2 Thí nghiệm 2
Ảnh hƣởng của tỉ lệ thu hoạch lên sự phát triển của tảo Thalassiosira sp.
Điều kiện nuôi giống thí nghiệm 1, môi trƣờng dinh dƣỡng sử dụng theo công thức tốt nhất từ thí nghiệm 1. Thí nghiệm đƣợc bố trí với 5 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.
NT1: Thu hoạch 20%/ ngày NT2: Thu hoạch 30%/ ngày NT3: Thu hoạch 40%/ ngày NT4: Thu hoạch 50%/ ngày NT5: Không thu hoạch
Hệ thống thí nghiệm: 15 bình tam giác 1L
Nguồn nƣớc và nguồn tảo đƣợc chuẩn bị tƣơng tự nhƣ thí nghiệm 1. Các yếu tố theo dõi mục 3.4
Thu hoạch tảo: thu hoạch hằng ngày vào khoảng 8 giờ sáng dùng ống nhựa hút mẫu qua ống đong và cấp nƣớc vào theo đúng tỷ lệ thu hoạch (nƣớc có dinh dƣỡng đầy đủ).
Thí nghiệm kết thúc khi mật độ tảo Thalassiosira sp. ở các nghiệm thức bắt đầu giảm.
3.4. Các yếu tố theo dõi
Xác định mật độ tảo: Tảo đƣợc thu lúc 8 giờ sáng mỗi ngày bằng cách sử
dụng Micropipet 1ml và cố định mẫu bằng formol 100µl và xác định bằng buống đếm Burker. Phƣơng pháp đếm và công thức xác định mật độ tảo theo Coutteau (1996)
Số tế bào tảo/ml = ((n1+n2)/160)*10^6*d
Trong đó:
n1: số tế bào ở buồng đếm thứ nhất n2: số tế bào ở buồng đếm thứ hai d: hệ số pha loãng
-22-
Công thức tính tốc độ tăng trƣởng của tế bào tảo (E Valenzuela-Espinoza,
2007)
µ = ln (N1 ) - lnN0) /t1 – t0
Trong đó : µ: Tốc độ tăng trƣởng.
N1 : Mật độ tảo tại thời điểm t1 . N0: Mật độ tảo tại thời điểm t0. Phƣơng pháp xác định các yếu tố môi trƣờng:
Nhiệt độ, pH, NO3- và NH4+ : ba ngày thu mẫu một lần, đối với nhiệt độ và pH sử dụng máy đo pH. NO3-
phân tích bằng phƣơng pháp khử cadmium và NH4+ phân tích bằng phƣơng pháp Phenate.
3.5 Xử lý số liệu
Các thông số nhƣ giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, vẽ đồ thị, phân tích phƣơng sai một yếu tố đƣợc xử lý bằng chƣơng trình Excel 2007. Kiểm định thống kê bằng SPSS 16.0.
-23-
CHƢƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Theo Andersen et al. (1997) Thallasiosira pseudonana có chiều rộng trung bình 4-5 µm và trong quá trình thí nghiệm Thalassiosira sp. đo đƣợc với kích thƣớc trung bình 3-5 x 5-9 µm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng lên sự phát triển của tảo
Thalassiosira sp.
4.1.1 Nhiệt độ
Nhiệt độ không có sự biến động lớn giữa các nghiệm thức qua các đợt thu mẫu, nhiệt độ dao động trong khoảng 26,2 – 30,5. Nó nằm trong khoảng nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy Tetraselmis sp. và Tetraselmis subcordiformis 20 – 30oC (Chen, 1991). Nhiệt độ không những ảnh hƣởng trực tiếp hoặc gián tiếp lên quá trình trao đổi chất mà còn tác động lên cấu trúc tế bào (Payer, 1980). Do đó mỗi loài tảo cần nuôi ở một khoảng nhiệt độ thích hợp, ngoài ngƣỡng nhiệt độ tảo sẽ không phát triển và có thể bị chết. Theo Coutteau (1996) nhiệt độ thích hợp cho tất cả các loài tảo phát triển là 16 – 35oC.
4.1.2 pH
pH là một trong những chỉ tiêu rất quan trọng đối với đời sống của tảo và ngƣợc lại sự phát triển của tảo cũng ảnh hƣởng đến pH.
Bảng 4.1 pH trung bình của các nghiệm thức trong thí nghiệm 1
Ngày NT W NT U NT B NT F NT A NT N
1 8,0 ± 0,66 8,3 ± 0,16 8,4 ± 0,26 8,2 ± 0,21 8,3 ± 0,09 8,3 ± 0,21
4 8,5 ± 0,29 8,5 ± 0,11 8,4 ± 0,09 8,4 ± 0,13 8,5 ± 0,12 8,6 ± 0,22
7 8,8 ± 0,10 8,6 ± 0,22 8,5 ± 0,33 8,6 ± 0,23 8,5 ± 0,3 8,6 ± 0,13
Biến động pH ở các nghiệm thức không khác biệt nhau trong suốt quá trình thí nghiệm, nhìn chung pH có xu hƣớng tăng dần, nguyên nhân là do tảo phát triển hấp thu CO2 cho quả trình quang hợp làm biến động hệ đệm cacbonate – bicacbinate, đồng thời sự hấp thu NO3- của tảo cũng làm pH tăng (Oh – Hama, 1986). Theo đề nghị của Coutteau (1996) thì pH tối ƣu cho tảo là 8,2 – 8,7. pH
-24-
trong các nghiệm thức ở khoảng thích hợp cho sự phát triển của tảo Thalassiosira sp. pH ở ngày đàu bố trí thí nghiệm ở các nghiệm thức NT W, NT U, NT B, NT F, NT A, NT N lần lƣợt là 8,0 ± 0,66; 8,3 ± 0,16; 8,4 ± 0,26; 8,2 ± 0,21; 8,3 ± 0,09 và 8,3 ± 0,21 và đến ngày kết thúc thí nghiệm pH ở các nghiệm thức dao động 8,4 – 8,8. Theo E Valenzuela-Espinoza (2007) pH thích hợp nuôi tảo Thalassiosira pseudonana trong khoảng 7,3 – 8,5. Đây cũng nằm trong khoảng tối ƣu cho sự phát triển của Nannochloropis oculata 7,5-8,5 (Okauchi, 2004).
4.1.3 TAN
Đạm là nguyên tố dinh dƣỡng rất cần thiết cho sự phát triển của tảo và thủy sinh vật và cũng là nhân tố giới hạn đối với đời sống thủy sinh vật.
Hàm lƣợng TAN của các nghiệm thức tƣơng đối thấp, vì môi trƣờng nuôi cấy có hàm lƣợng chất dinh dƣỡng đƣợc bổ sung chủ yếu là NO-
3 nên hàm lƣợng TAN rất thấp ở đợt thu mẫu đầu tiên và bị hấp thu hết qua các đợt thu mẫu kế tiếp. Hàm lƣợng TAN ở ngày đầu bố trí của các nghiệm thức NT W, NT U, NT B, NT F, NT A, NT N lần lƣợt là 0,91 ± 0,01 mg/l; 0,81 ± 0,01 mg/l; 1,03 ± 0,03
mg/l; 0,78 ± 0,01 mg/l; 0,98 ± 0,01 mg/l; 0,69 ± 0,55 mg/l. Hàm lƣợng TAN có khuynh hƣớng giảm dần từ lúc bắt đầu thí nghiệm cho cuối thí nghiệm, riêng nghiệm thức NTB có dấu hiệu tăng lên sau đó có thể do tảo tàn, xác tảo phân hủy trả lại môi trƣờng nuôi.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1 4 7 NT W NT U NT B NT F NT A NT N mg/l
Hình 4.1 Biến động TAN các nghiêm thức ở thí nghiệm 1
-25-
Bảng 4.2 Hàm lƣợng TAN (mg/l) trung bình các nghiệm thức trong TN1
Ngày NT W NT U NT B NT F NT A NT N
1ns 0,91 ± 0,01 0,81 ± 0,01 1,03 ± 0,03 0,78 ± 0,01 0,98 ± 0,01 0,69 ± 0,55
4* 0,10 ± 0,03b 0,11 ± 0,08b 0,10 ± 0,01b 0,07 ± 0,05b 0,23 ± 0,10a 0,22 ± 0,01a
7* 0,07 ± 0,04b 0,07 ± 0,05b 0,29 ± 0,09a 0,05 ± 0,02b 0,06 ± 0,02b 0,13 ± 0,04b
Ghi chú: ns: Không khác biệt
*: Khác biệt có ý nghĩa p<0,05
4.1.4 Nitrate (NO3-) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nitrate là sản phẩm cuối cùng của quá trình oxy hóa amoniac, không độc đối với thủy sinh vật. Đây là chất dinh dƣỡng đƣợc tảo hấp thu trực tiếp và chuyển hóa thành chất hữu cơ thông qua quá trình quang hợp. Do môi trƣờng dinh dƣỡng của các nghiệm thức khác nhau dẫn đến hàm lƣợng dinh dƣỡng ban đầu trong môi trƣờng nƣớc khác nhau.
Theo Richmond (1986), muối dinh dƣỡng mà tảo hấp thụ chủ yếu là nitrate và đây là chất dinh dƣỡng chính cho sự phát triển của tảo, vì vậy các nghiệm thức có khuynh hƣớng giảm dần đến gần cuối thí nghiệm.
Bảng 4.3 Hàm lƣợng nitrate trung bình (mg/l) các nghiệm thức trong TN1
Ngày NT W NT U NT B NT F NT A NT N
1 45,1 ± 0,21c 39,0 ± 0,34d 92,4 ± 0,46a 26,9 ± 0,59e 57,9 ± 0,36b 14,2 ± 3,96f
4 3,0 ± 0.96c 5,3 ± 0.65b 7,9 ± 2,41a 7,4 ± 0.86ab 6,7 ± 1,26ab 6,0 ± 0,54ab
7 8,5 ± 0,12abc 9,9 ± 1,83a 8,4 ± 3.37abc 5,5 ± 1,48d 6,0 ± 0,21bc 8,9 ± 0,29ab
Ghi chú: Các trị số trên nằm cùng một hàng có kí tự giống nhau là không có sự khác biệt. Các kí tự khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p<0,05
-26-
Nhìn chung, hàm lƣợng nitrate có xu hƣớng giảm nhanh từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 4, do thời gian này tốc độ tăng trƣởng của tảo cao (Bảng 4.5), tảo sử dụng nguồn đạm nhiều. Và sau đó tăng lên ở các ngày tiếp theo đến khi kết thúc thí nghiệm. Riêng NTF và NTA thì tiếp tục giảm. Hàm lƣợng nitrate trung bình của các nghiệm thức NT W; NT U; NT B; NT F; NT A và NT N ở ngày đầu tiên bố trí thí nghiệm lần lƣợt là 45,1 ± 0,21 mg/l; 39,0 ± 0,34 mg/l; 92,4 ± 0,46 mg/l;
26,9 ± 0,59 mg/l; 57,9 ± 0,36 mg/l; 14,2 ± 3,96 mg/l. Nhƣ vậy có thể thấy hàm
lƣợng nitrate có sự khác biệt giữa các nghiệm thức trong thí nghiệm, điều này là một trong những nguyên nhân làm cho sự phát triển của tảo ở các nghiệm thức khác nhau.
4.1.5 Sự phát triển của tảo
Trên thế giới có nhiều môi trƣờng dinh dƣỡng đƣợc sử dụng để nuôi tảo khuê. Tùy theo chính chất nƣớc, điều kiện khí hậu mà ta chọn nuôi sao cho thích hợp nhằm thu đƣợc sinh khối cao với chi phí sản xuất thấp nhất. Sáu môi trƣờng dinh dƣỡng đƣợc chọn để nuôi thử nghiệm tảo Thalassiosira sp là: Môi trƣờng Walne (1970); Môi trƣờng Ukeles; Môi trƣờng Ben-Amozt (1987); Môi trƣờng Guillard f/2 (1975); Môi trƣờng Algal-l; Môi trƣờng phân N:P:K.
Kết quả về mật độ tảo cũng đã khẳng định rằng sự phát triển của tảo phụ thuộc nhiều vào môi trƣờng dinh dƣỡng đã bố trí ở các nghiệm thức.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 4 7 NT W NT U NT B NT F NT A NT N mg/l Ngày Hình 4.2 Biến động NO-
-27-
Trong 6 môi trƣờng dinh dƣỡng đã đƣợc thực nghiệm thì 2 môi trƣờng dinh dƣỡng Walne và Ben-Amozt có số lƣợng tế bào đạt cực đại nhỏ nhất tƣơng ứng là 1,46 ± 0,12 x 106
tb/ml; 1,37 ± 0,08 x 106 tb/ml và thời gian đạt cực đại cũng sớm hơn 3 môi trƣờng còn lại vào ngày nuôi thứ 5. Trong quá trình thí nghiệm quan sát thấy môi trƣờng Ben-Amozt có dấu hiệu suy tàn nhanh chóng có thể là do hàm lƣợng NO-
3, TAN trong hai nghiệm thức quá thấp dẫn đến tảo không đủ chất dinh dƣờng để phát triển. Bốn môi trƣờng còn lại là Ukeles; Guillard f/2; Algal-l; phân N:P:K thời gian đạt cực đại đều chậm hơn hai môi trƣờng trên là vào ngày thứ 6, tuy nhiên số lƣợng tế bào đạt cực đại trong môi trƣờng F2 cao hơn so với môi trƣờng phân N:P:K; Algal-lvà Ukeles tƣơng ứng là 1,99 ± 0,18 x 106; 1,69 ± 0,03 x 106; 1,63 ± 0,14 x 106 và 1,49 ± 0,02 x 106 tb/ml. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 1 2 3 4 5 6 7 8 NT W NT U NT B NT F NT A NT N Triệu tb/ml
Hình 4.3 Biến động mật độ tảo giữa các nghiệm thức trong thí nghiệm 1
-28-
Bảng4.4 Mật độ tảo trung bình giữa các nghiệm thức trong TN 1 (triệutb/ml)
Ngày NT W NT U NT B NT F NT A NT N 1 0,29 ± 0,01a 0,30 ± 0,01a 0,29 ± 0,02a 0,30 ± 0,02a 0,30 ± 0,02a 0,29 ± 0,01a 2 0,65 ± 0,05b 0,65 ± 0,05b 0,67 ± 0,04b 0,83 ± 0,03a 0,73 ± 0,07b 0,71 ± 0,06b 3 0,83 ± 0,04c 0,96 ± 0,06b 0,96 ± 0,04b 1,17 ± 0,07a 1,06 ± 0,03a 1,04 ± 0,04bc 4 1,12 ± 0,04c 1,22 ± 0,04abc 1,16 ± 0,14bc 1,36 ± 0,04a 1,25 ± 0,07abc 1,28 ± 0,05ab 5 1,46 ± 0,12bc 1,31 ± 0,04c 1,37 ± 0,08bc 1,72 ± 0,14a 1,41 ± 0,06bc 1,50 ± 0,03b 6 1,36 ± 0,16b 1,49 ± 0,02b 1,31 ±0,11b 1,99 ± 0,18a 1,63 ± 0,14b 1,69 ± 0,03b 7 1,27 ± 0,05b 1,28 ± 0,04b 1,24 ± 0,10b 1,57 ± 0,08a 1,30 ± 0,05b 1,33 ± 0,12b 8 1,15 ± 0,08bc 1,20 ±0,06b 1,05 ±0,11c 1,35 ± 0,02a 1,22 ± 0,04ab 1,25 ± 0,10ab
Ghi chú: Các trị số trên nằm cùng một hàng có kí tự giống nhau là không có sự khác biệt. Các kí tự khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p<0,05
Ở cả 6 môi trƣờng dinh dƣỡng sử dụng trong thí nghiệm tảo Thalassiosira sp. đều có thể sinh trƣởng và phát triển. Tuy nhiên trong 6 nghiệm thức đó thì nghiệm thức sử dụng môi trƣờng dinh dƣỡng Guillard f/2 cho tốc độ tăng trƣởng của tảo Thalassiosira sp. là cao nhất. Kết quả này là cao hơn với kết quả đề tài “Ảnh hƣởng của một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển của quần thể tảo
Thalassiosira sp. nhập nội và thử nghiệm nuôi sinh khối” mật độ tảo sau 9 ngày