2.6.1 Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng có thể dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ.
2.6.2 Lịch sử ra đời
HPLC là chữ của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành
Trang 22
chế tạo máy phân tích. HPLC được áp dụng trong nhiều ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thực phẩm và dược phẩm. Hiện nó là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần, cho phép định tính và định lượng.
2.6.3 Các bộ phận cơ bản của thiết bị HPLC
Hình 2.5 Sơ đồ máy HPLC Trong đó:
(1) Bình chứa dung môi pha động. (2) Bộ phận khử khí.
(3) Bơm cao áp. (4) Bộ phận tiêm mẫu.
(5) Cột sắc ký (pha tĩnh) (để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt). (6) Detector (nhận tín hiệu).
(7) Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu và xử lý dữ kiệu, điều khiển hệ thống HPLC.
(8) In dữ liệu.
2.6.4 Nguyên tắc hoạt động
Bơm cao áp đẩy dung môi pha động qua cột. Các chất tương tác với cột tách. Hỗn hợp chất phân tách thành những phân đoạn khác nhau. Khi các chất ra khỏi cột tách được phát hiện bởi một đầu dò thích hợp. Đầu dò truyền tín hiệu phát hiện được về bộ phận xử lý tín hiệu. Bộ phận xử lý diễn đạt phân đoạn chất phát hiện được ở dạng peak trên màn hình điều khiển.
Trang 23
2.7 Giới thiệu về phổ hấp thu nguyên tử (AAS)[2][4]2.7.1 Nguyên tắc hoạt động của phép đo AAS 2.7.1 Nguyên tắc hoạt động của phép đo AAS
Phương pháp phân tích dựa trên cơ sở đo phổ hấp thu nguyên tử của một nguyên tố được gọi là phép đo phổ hấp thu nguyên tử (phép đo AAS). Cơ sở lý thuyết của phép đo này là sự hấp thu năng lượng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử tự do ở trong trạng thái hơi (khí) khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi nguyên tử của nguyên tố ấy trong môi trường hấp thu. Vì thế, muốn thực hiện được phép đo phổ hấp thu nguyên tử của một nguyên tố cần phải thực hiện các quá trình sau:
Chọn các điều kiện và hệ thống nguyên tử hóa mẫu phù hợp để chuyển mẫu phân tích từ trạng thái ban đầu (rắn hay dung dịch) thành trạng thái hơi của các nguyên tử tự do. Nhờ đó chúng ta có được đám hơi nguyên tử tự do của các nguyên tố trong mẫu phân tích. Đám hơi này chính là môi trường hấp thu bức xạ và sinh ra phổ hấp thu nguyên tử.
Chiếu chùm tia sáng bức xạ đặc trưng của nguyên tố cần phân tích qua đám hơi nguyên tử vừa điều chế được ở trên. Các nguyên tử của các nguyên tố cần xác định trong đám hơi đó sẽ hấp thu những tia bức xạ nhất định và tạo ra phổ hấp thu của nó. Ở đây, phần cường độ của chùm tia sáng đã bị một loại nguyên tử hấp thu là phụ thuộc vào nồng độ của nó trong môi trường hấp thu. Nguồn cung cấp chùm tia sáng phát xạ của nguyên tố cần nghiên cứu được gọi là nguồn phát bức xạ đơn sắc hay bức xạ cộng hưởng.
Tiếp đó, nhờ một hệ thống máy quang phổ, người ta thu toàn bộ chùm sáng, phân ly và chọn một vạch phổ hấp thu của nguyên tố cần nghiên cứu để đo cường độ của nó. Cường độ đó chính là tín hiệu hấp thu của vạch phổ hấp thu nguyên tử. Trong một giới hạn nhất định của nồng độ C, giá trị của cường độ này là phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C của nguyên tố ở trong mẫu phân tích theo phương trình Dλ=a.Cb.
2.7.2 Trang bị để nguyên tử hóa mẫu
Hệ thống máy đo phổ hấp thu nguyên tử bao gồm các phần cơ bản sau:
Phần 1: Nguồn phát tia bức xạ cộng hưởng (vạch phổ đặc trưng của
nguyên tố cần phân tích), để chiếu vào môi trường hấp thu chứa các nguyên tử tự do của nguyên tố. Đó là các đèn catod rỗng (HCL), các đèn phóng điện không điện cực (EDL), hay nguồn phát bức xạ liên tục đã được biến điệu.
Phần 2: Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích. Hệ thống này được chế
tạo theo hai loại kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu. Đó là kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa đèn khí (F-AAS) và kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa (ETA-AAS).
Trong kỹ thuật nguyên tử hóa ngọn lửa, hệ thống này bao gồm:
Bộ phận dẫn mẫu vào buồng aerosol hóa và thực hiện quá trình aerosol hóa mẫu (tạo thể sol khí).
Trang 24
Đèn để nguyên tử hóa mẫu (burner head) để đốt cháy hỗn hợp khí có chứa mẫu ở thể huyền phù sol khí.
Ngược lại, khi nguyên tử hóa mẫu bằng kỹ thuật không ngọn lửa, người ta thường dùng một lò nung nhỏ bằng graphit (cuvet graphite) hay thuyền Tangtan (Ta) để nguyên tử hóa mẫu nhờ nguồn năng lượng điện có thế thấp (nhỏ hơn 12 V) nhưng nó có dòng rất cao (50-800 A).
Phần 3: Là máy quang phổ. Nó là bộ đơn sắc, có nhiệm vụ thu, phân ly
và chọn tia sáng (vạch phổ) cần đo hướng vào ống nhân quang điện để phát hiện tín hiệu hấp thu AAS của vạch phổ.
Phần 4: Là hệ thống chỉ thị tín hiệu hấp thu của vạch phổ tức là cường
độ của vạch phổ hấp thu hay nồng độ nguyên tố phân tích. Hệ thống này có thể là các trang bị:
+ Đơn giản nhất là một điện kế chỉ năng lượng hấp thu (E) của vạch phổ. + Một máy tự ghi peak của vạch phổ.
+ Hoặc bộ hiện số (digital). + Bộ máy in (printer).
+ Hoặc máy phân tích (intergrator).
Với các máy hiện đại còn có thêm một microcomputer hay microprocessor, và hệ thống phần mềm. Loại trang bị này có nhiễm vụ điều khiển quá trình đo và xử lý các kết quả đo đạc, vẽ đồ thị, tính nồng độ của mẫu phân tích...
Trang 25
CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm: Phòng Lý Hóa Thực Phẩm – Trung Tâm Y Tế Dự Phòng Thành Phố Cần Thơ.
Địa chỉ: Số 1, đường Ngô Đức Kế, phường An Lạc, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ.
Đề tài được thực hiện từ tháng 08/2013 đến tháng 11/2013.
3.2 Hoạch định thí nghiệm
- Lựa chọn các chỉ tiêu hóa lý để kiểm tra chất lượng hạt nêm theo TCVN, FAO, AOAC, sách Kiểm nghiệm lương thực phẩm của Phạm Văn Sổ.
- Phân tích các chỉ tiêu hóa lý của 15 mẫu hạt nêm chiết xuất từ thịt heo tại 3 chợ trên địa bàn thành phố Cần Thơ
Độ ẩm Hàm lượng muối Hàm lượng protid Hàm lượng Gluxit Hàm lượng bột ngọt Hàm lượng Pb, Cd Hàm lượng As
Hàm lượng chất bảo quản potasium sorbate, sodium benzoate - Đánh giá kết quả phân tích được của 15 mẫu hạt nêm chiết xuất từ thịt heo tại 3 chợ trong thành phố Cần Thơ.
3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu
Tiến hành lấy mẫu theo TCVN 4889-1989
Từ các mẫu ban đầu cho ra khay trộn đều để có được mẫu chung. Lượng mẫu chung phải không ít hơn 3 lần lượng mẫu cần dùng cho tất cả các phép thử tùy theo quy cách phẩm chất của mỗi loại gia vị.
Bằng phương pháp chia chéo lấy ra một lượng mẫu đủ để làm phân tích (mẫu phân tích).
Mẫu phân tích được bảo quản trong lọ thủy tinh hoặc lọ nhựa (hộp nhựa) có nắp đậy kín trên lọ hoặc hộp có dán nhãn ghi rõ: Ngày lấy mẫu, Tên và địa chỉ người lấy mẫu, Tên sản phẩm, Hạng, Thứ, Năm sản xuất
Trang 26
3.3.2 Phương pháp phân tích
Từ các tài liệu tìm hiểu được như FAO, AOAC, TCVN, sách Kiểm nghiệm lương thực – thực phẩm của Phạm Văn Sổ,…Ta chọn được các phương pháp phân tích sau:
- Xác định độ ẩm theo phương pháp sấy
- Xác định hàm lượng muối theo phương pháp Morh - Xác định hàm lượng protein theo phương pháp kejldahl - Xác định hàm lượng gluxit theo phương pháp Bertrand - Xác định hàm lượng bột ngọt theo phương pháp so màu - Xác định hàm lượng Pb, Cd bằng phương pháp GF-AAS - Xác định hàm lượng As bằng HG-AAS
- Xác định hàm lượng chất bảo quản bằng phương pháp HPLC-DAD
3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2010.
3.4 Thiết bị và dụng cụ
- Tủ sấy (MEMMERT). - Lò nung (NABERTHERM). - Bể siêu âm (ELAM). - Cân phân tích.
- Máy HPLC (HITACHI) . - Bình hút ẩm. . - Chén sứ và cốc sứ. - Bể đun cách thủy.
- Giấy lọc cho HPLC 0,45 µm. - Máy AAS Analytik Jena - Máy cất đạm Parnas
- Các dụng cụ thủy tinh thông thường trong phòng thí nghiệm như: pipet, bình tam giác, ống đong, bình định mức, phiễu,…
Hình 3.2 Bể siêu âm
Hình 3.1 Máy chưng cất đạm Parnas
Trang 27 Hình 3.4 Tủ sấy Hình 3.5 Máy HPLC-DAD 3.5 Hóa chất - AgNO3 0,1 N - NaOH 0,1 N
- Carrez I (K4[Fe(CN)6]) 15% - Carrez II (ZnSO4) 23% - CH3COONH4 0,02 M (Merck) - Nước cất dùng cho HPLC
- KMnO4 0,1 N - Feling A
- Feling B - K2CrO4 10%
- NaOH 10% - Diethyl ether
- Petroleum ether - KOH 12 N
Trang 28
3.6 Đối tượng phân tích
Đối tượng nghiên cứu là các mẫu hạt nêm lưu thông trên địa bàn thành phố Cần Thơ.
Bảng 3.1 Một số mẫu hạt nêm khảo sát
Mẫu Thương hiệu Địa điểm lấy mẫu
1 Hạt nêm xương hầm Vedan Chợ Xuân Khánh
2 Hạt nêm Wow Chợ Xuân Khánh
3 Hạt nêm thịt thăn và xương ống Chợ Xuân Khánh 4 Hạt nêm Aji-ngon xương hầm và thịt Chợ Xuân Khánh 5 Hạt nêm Magi, xương hầm 3 ngọt vị heo Chợ Xuân Khánh
6 Hạt nêm xương hầm Vedan Chợ An Bình
7 Hạt nêm Wow Chợ An Bình
8 Hạt nêm thịt thăn và xương ống Chợ An Bình 9 Hạt nêm Aji-ngon xương hầm và thịt Chợ An Bình 10 Hạt nêm Magi, xương hầm 3 ngọt vị heo Chợ An Bình
11 Hạt nêm xương hầm Vedan Chợ Hưng Lợi
12 Hạt nêm Wow Chợ Hưng Lợi
13 Hạt nêm thịt thăn và xương ống Chợ Hưng Lợi 14 Hạt nêm Aji-ngon xương hầm và thịt Chợ Hưng Lợi 15 Hạt nêm Magi, xương hầm 3 ngọt vị heo Chợ Hưng Lợi
3.7 Thực nghiệm 3.7.1 Xác định độ ẩm 3.7.1 Xác định độ ẩm
Nguyên tắc
Dùng sức nóng làm bay hết hơi nước trong hạt nêm. Cân trọng lượng trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong hạt nêm.
Yêu cầu
Dựa theo TCVN 7396:2004 của bột canh gia vị là ≤ 3% Dụng cụ, thiết bị
- Tủ sấy. - Bình hút ẩm.
- Chén sứ. - Cân phân tích.
Cách tiến hành
Cân chính xác 10 g mẫu đã chuẩn bị sẵn, cho vào chén sứ khô đã biết khối lượng. Cho vào tủ sấy sấy ở 105C trong 6 giờ, sấy khô cho đến trọng lượng không đổi.
Sấy xong, làm nguội ở bình hút ẩm 30 phút rồi cân. Tiếp tục sấy rồi cân đến khối lượng không đổi, thời gian mỗi lần sấy tiếp theo là 30 phút.
Kết quả giữa 2 lần sấy và cân liên tiếp không được cách nhau quá 0,5 mg cho mỗi gam chất thử.
Trang 29 Tính kết quả:
Độ ẩm theo % (X) được tính bằng công thức : 100 1 2 3 2 (%) m m m m X Trong đó: m1: Trọng lượng của chén sứ (g)
m2: Trọng lượng của chén sứ và mẫu cân trước khi sấy (g) m3: Trọng lượng của chén sứ và mẫu cân sau khi sấy (g).
3.7.2 Xác định hàm lượng NaCl
Nguyên tắc
Áp dụng phản ứng
NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3
Cho dung dịch chuẩn AgNO3 vào dung dịch mẫu trung tính có chứa NaCl, phản ứng trên xảy ra. Khi NaCl trong dung dịch đã kết hợp hết với dung dịch AgNO3, một giọt AgNO3 thừa sẽ kết hợp với K2CrO4 (dùng làm chỉ thị màu) cho Ag2CrO4 màu đỏ gạch (phản ứng đã kết thúc)
2AgNO3 + K2CrO4 Ag2CrO4 + KNO3
Từ lượng AgNO3 đã sử dụng, ta có thể tính ra hàm lượng NaCl trong 100 g thực phẩm. Dụng cụ, thiết bị - Bình định mức - Buret - erlen - Pipet Hóa chất - AgNO3 0,1 N - K2CrO4 10% - NaOH 10% - Giấy pH Cách tiến hành
Cân chính xác 0,5 g hạt nêm cho vào một beaker hòa tan cho tan hết, sau đó cho vào bình định mức 100 mL thêm nước gần đủ 100 mL. Kiểm tra lại dung dịch có trung tính hay không, nếu không thì trung hòa bằng NaOH 10%.
Lấy 10 mL dung dịch trên cho vào bình tam giác, thêm 3 giọt K2CrO4 10% rồi chuẩn độ bằng dung dịch AgNO3 0,1 N đến khi dung dịch xuất hiện màu đỏ gạch bền vững.
Trang 30 Tính kết quả: 4 3 1 2 ) 0,00585 100 ( V m V V V X Trong đó:
V1 - là thể tích dung dịch AgNO3 0,1 N sử dụng trong chuẩn độ mẫu trắng (mL)
V2 - là thể tích dung dịch AgNO3 0,1 N sử dụng trong chuẩn độ mẫu thử (mL) V3 - dung tích bình định mức, mL
V4 - thể tích dịch lọc dùng để chuẩn độ, mL
0,00585 - lượng NaCl tương ứng với 1 mL dung dịch AgNO3 0,1 N, tính bằng gam (g)
100 - là hệ số quy đổi ra 100 g thực phẩm m – lượng mẫu cân, g
Kết quả là trung bình cộng của kết quả 2 lần xác định song song. Tính chính xác đến 0,01%.
Chênh lệch giữa kết quả 2 lần xác định song song không lớn hơn 0,02%
3.7.3 Xác định hàm lượng protid
Nguyên tắc
Vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc với sự hiện diện của chất xúc tác, nitơ có trong mẫu chuyển thành amonium sulfate. Dùng một kiềm mạnh (KOH) đẩy NH3 ra khỏi muối (NH4)2SO4 trong máy cất đạm. NH3 sinh ra được hấp thu vào dung dịch axit H2SO4 chuẩn với lượng thừa biết trước . Sau đó định lượng lại lượng axit thừa này bằng dung dịch NaOH chuẩn.
Các phản ứng xảy ra trong quá trình: K2SO4, CuSO4 Chất hữu cơ + H2SO4đ (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 + 2KOH K2SO4 + 2NH3 + 2H2O 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O Dụng cụ, thiết bị - Bình Kejhdahl - Bộ chưng cất đạm - Buret - Bình định mức - Beaker - Pipet Hóa chất - H2SO4 0,1 N - NaOH 0,1 N
- Phenolphtalein 1% - Sodium alizarin sulfonate 1%
- KOH 12 N - H2SO4 đặc
Trang 31 Cách tiến hành
Vô cơ hóa mẫu: Cân chính xác 0,2 g hạt nêm cho vào bình Kjeldahl,
thêm 1 mL CuSO4 10%, 1 g K2SO4 và 2 mL H2SO4 đậm đặc. Lắc đều, đậy bằng phiễu thủy tinh, để bình nghiêng 60o trên bếp đun. Đun từ từ cho đến khi dung dịch trong ống trong suốt hoặc có màu xanh lơ của dung dịch CuSO4, để nguội. Lúc này, các chất đạm trong hạt nêm đã chuyển thành muối (NH4)2SO4. Quá trình vô cơ hóa được thực hiện trong tủ hút để tránh ngộ độc hơi SO2
trong quá trình đun.
Chưng cất đạm: chuyển mẫu đã vô cơ hóa vào bình cầu của bộ chưng
cất đạm, rửa bình Kjeldahl 2 lần với nước cất, chuyển vào bình cầu và thêm 4 giọt phenolphtalein 1%. Kiềm hóa bằng dung dịch KOH 12 N hoặc NaOH 40%. Cất kéo hơi nước và lượng NH3 sinh ra sang một cốc có chứa sẵn 10 mL H2SO4 0,1 N. Sau khi cất kéo hơi nước hết NH3 (giấy quỳ tím ẩm không