1.2.2.1 AHL ở Methylobacterium và vai trị của nĩ trong hệ thống Quorum
sensing
Ba nghiên cứu gần đây đã chứng minh vi khuẩn Methylobacterium spp. cĩ khả
năng sinh tổng hợp N-acyl homoserine lactone (AHL) [118], [120], [121]. Đây là
những phân tử tín hiệu trong hệ thống điều hịa Quorum sensing (QS) ở vi sinh vật. Hệ thống này tham gia điều hịa nhiều hoạt động sống quan trọng của vi sinh vật, đồng thời là cầu nối tương tác giữa thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, các nghiên
cứu trên vi khuẩn Methylobacterium spp. này chỉ định tính được sự sinh tổng hợp
các loại phân tử AHL, chưa giải thích các cơ chế tương tác của vi khuẩn trên cơ sở cơ chế QS. Chính vì thế, việc hiểu rõ cơ chế QS ở các vi sinh vật khác và ở trên thực vật sẽ là nền tảng cho việc chứng minh, giải thích mối tương tác của vi khuẩn
36
Methylobacterium spp.. Đĩ cũng là cơ sở cho việc áp dụng vi khuẩn
Methylobacterium spp. một cách cĩ hiệu quả. -Định nghĩa
Quorum sensing (QS, cell-to-cell communication) cĩ thể hiểu như là sự điều hịa biểu hiện gen phụ thuộc vào mật độ quần thể vi sinh vật (hình 1.15). Cơ chế này cho phép các tế bào vi sinh vật đơn lẻ trong một quần thể phối hợp biểu hiện một số gen nhất định, giúp chúng tương tác như một sinh vật đa bào. QS hoạt động thơng qua sự trao đổi những phân tử tín hiệu nhỏ giữa các tế bào vi khuẩn kế cận nhau. Khi quần thể cục bộ gia tăng, thì nồng độ tín hiệu cũng tăng theo. “Quorum” của vi khuẩn hiện diện khi nồng độ tín hiệu đạt ngưỡng đủ để kích thích những thay đổi trong biểu hiện gen. Rất nhiều hoạt động của vi khuẩn bắt nguồn từ sự điều hịa QS, chẳng hạn như phát quang, hình thành bào tử, di động, tổng hợp kháng sinh, tiếp hợp và sự tổng hợp các yếu tố gây độc trên động vật và thực vật.
Hình 1.15. Tương tác quorum sensing. Ở mật độ quần thể thấp, sự tổng hợp các phân tử autoinducer dẫn tới khuếch tán nhanh chĩng các phân tử này ra mơi trường xung quanh. Ở mật độ quần thể cao, sự gia tăng số lượng tế bào dẫn đến tích tụ các autoinducer trên ngưỡng, hoạt hĩa sự đáp ứng của các protein điều hịa. Các protein này, đến lượt mình, lại khởi động một loạt các đáp ứng QS [61].
Ở Pseudomonas aeruginosa, 5-20% số gen cĩ liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự điều hịa QS. QS đặc biệt quan trọng đối với khả năng xâm nhiễm thành cơng vật chủ của các vi khuẩn gây bệnh. Ở các vi khuẩn này, các đột biến bất hoạt QS thường khơng độc hoặc tính độc giảm đi đáng kể. Ngồi ra, QS cũng rất cần cho sự điều hịa biểu hiện gen và hoạt động của các vi khuẩn cộng sinh với thực vật [31], [32], [56].
Cĩ nhiều loại tín hiệu quorum sensing khác nhau đã được phát hiện ở cả vi khuẩn Gram âm lẫn Gram dương. Ở các vi khuẩn Gram âm, một trong những phân tử tín hiệu phổ biến và được nghiên cứu kĩ nhất là các N-acyl homoserine lactone (AHL) với chiều dài mạch N-acyl từ 4-14 carbon [56], cịn ở các vi khuẩn Gram dương, quorum sensing được thực hiện qua các peptide ngắn [32].
Hệ thống điều hịa sinh tổng hợp AHL điển hình rất đơn giản, bao gồm 2 protein thuộc họ LuxI và LuxR. Trong đĩ, LuxI đĩng vai trị sinh tổng hợp AHL cịn LuxR sinh tổng hợp nhân tố điều hịa sinh tổng hợp AHL (hình 1.16) [54].
Hình 1.16.Hệ thống điều hịa sinh tổng hợp AHL ở vi khuẩn Garm âm. LuxI đĩng
vai trị sinh tổng hợp AHL từ S-adenosyl-methionine (SAM) và acetylated acyl. LuxR tham gia điều hịa biểu hiện LuxI và các gen trong cơ chế QS [54].
Bên cạnh AHL, một số phân tử khác cũng ảnh hưởng đến quorum sensing hoặc cĩ vai trị như những phân tử quorum sensing được sản xuất bởi thực vật và các vi khuẩn cư trú vùng căn quyển của thực vật. Chẳng hạn: như các dipeptide
38
Ralstonia solanacearum. Alteneria alternata hay Centaurea maculosa (bảng 1.9) [56], [61].
Bảng 1.9.Một số AHL và hoạt động phụ thuộc vào mật độ quần thể được điều hịa bởi AHL [56]
Cấu trúc R AHL Vi khuẩn Hoạt động
R1 R2
H H C4-HSL S. liquefaciens Di động
O H 3-hydroxy- V. harveyi Phát quang
H C6-HSL C. violaceum Sắc tố/ kháng O 3-oxo-C6- HSL E. carotovora P. aureofaciens Độc tính/ kháng sinh H C7-HSL R. leguminosarum ? O 3-oxo-C8- HSL A. tumefaciens Tiếp hợp O H 3-hydroxy- C14:1-HSL R. leguminosarum Ức chế tăng trưởng/ các gen vùng rễ - Vai trị của N-acyl homoserin lactone trong Quorum Sensing
+ Quorum sensing trong tương tác vi sinh vật-thực vật
Đối với các vi sinh vật gây bệnh cho thực vật thì cơ chế QS cĩ vai trị rất lớn, nĩ bảo đảm cho sự xâm nhiễm và gây bệnh thành cơng trên thực vật. Khởi đầu quá trình xâm nhiễm, nếu vi sinh vật biểu hiện ngay các gen gây độc thì đây sẽ là một điều kiện thuận lợi cho thực vật huy động các phản ứng phản vệ. Vì thế, cơ chế QS cho phép vi sinh vật phát triển mật độ quần thể và biểu hiện các gen gây độc trên ngưỡng chịu đựng của thực vật để đảm bảo một quá trình xâm nhiễm thành cơng [19]. Ngưỡng QS cĩ thể được qui định trên mức cần thiết để đảm bảo chắc chắn sự thành cơng của vi khuẩn khi xâm nhiễm. Nguyên nhân của hiện tượng này cĩ thể được giải thích là do: 1. Khơng cĩ cơ chế nhận biết vật chủ tiềm năng, nên vi khuẩn khơng cĩ khả năng điều chỉnh hoạt động đối với các lồi thực vật khác nhau, do đĩ đặt ngưỡng cao hơn khi biểu hiện các gen gây độc được xem như một chiến thuật tốt về mặt tiến hĩa; 2. Các vi khuẩn khác và thực vật cũng cĩ khả năng tạo ra các
AHL cĩ cấu trúc tương tự, làm cho vi khuẩn cĩ thể “ước đốn sai” mật độ quần thể của mình. Vì vậy việc đặt ngưỡng quần thể cao hơn cĩ thể là một cơ chế để trừ hao
cho hiện tượng này [56]. Quá trình gây thúi nhũn của Erwinia spp. hay tạo khối u
của Agrobacterium tumefaciens chính là những quá trình được điều hịa bằng cơ chế QS [61], [146]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khơng chỉ vi sinh vật, thực vật cũng cĩ khả năng tiếp nhận và phản ứng lại đối với những tín hiệu QS. AHL của vi khuẩn cĩ khả năng ảnh hưởng đáng kể đến sự tích lũy các protein liên quan đến đáp ứng tự vệ, biến dưỡng sơ cấp, đáp ứng hormone điều hịa phiên mã, biến đổi protein sau dịch mã hoặc hoạt động của bộ
xương tế bào ở Medicago truncatula [31] hay Arabidopsis thaliana [161]. Tương tự
như Medicago truncatula, ở cà chua cĩ sự đáp ứng tự vệ ở chồi sau khi rễ cây được xử lý với AHL [161]. Ngồi ra, homoserine lactone, là một trong những sản phẩm phân hủy của AHL bởi các vi khuẩn đất, cĩ tác dụng gia tăng thốt hơi nước, dẫn tới sự gia tăng dịng chảy của nước và khống từ đất tới vùng rễ, và điều này cĩ lợi cho cả vi khuẩn và thực vật [31].
Thêm vào đĩ, thực vật cịn cĩ khả năng tác động ngược trở lại với hệ thống QS của vi sinh vật. Chúng làm rối loạn QS của vi khuẩn bằng cách tiết ra những hợp chất “bắt chước” những tín hiệu QS của vi khuẩn, cơ chế này được gọi là QS mimic (hình 1.17).
QS mimic được nghiên cứu phổ biến nhất là các furanone halogen hĩa. Những
furanone này được tìm thấy ở tảo đỏ Delisea pulchra, cĩ cấu trúc tương tự như
AHL. Những furanone này hoạt động bằng cách liên kết với các receptor AHL của vi khuẩn và thúc đẩy sự phân hủy của các receptor. Furanone AHL mimic ảnh
hưởng đến cấu trúc biofilm của P. aeruginosain vitro và ngăn cản sự cảm ứng một
số chức năng gây độc của vi khuẩn này. Từ đây nhận thấy rất cĩ thể những cấu trúc tương đồng với AHL này sẽ là những loại kháng sinh mới trong tương lai. AHL
mimic được tinh sạch từ Chlamydomonas kích thích đặc hiệu thụ thể LasR của P.
40
hịa ở Sinorhizobium meliloti, vi khuẩn cộng sinh cố định đạm ở cây họ đậu. Cĩ lẽ
tương tác của một AHL mimic với một số thụ thể AHL dẫn tới sự hoạt hĩa phiên mã, trong khi đối với những thụ thể khác thì lại dẫn đến sự ngăn chặn kích thích của AHL hoặc ức chế thơng qua việc phân hủy các thụ thể [31], [145]. Thực vật bậc cao
(đậu, cà chua, Medicago truncatula, lúa…) cũng tiết ra các hợp chất ảnh hưởng đến
sự điều hịa AHL QS ở vi khuẩn. Đặc tính của các hợp chất AHL mimic này vẫn chưa được biết rõ, tuy nhiên hầu hết các hợp chất này cĩ tương tác đặc hiệu với những protein receptor AHL [31].
Hình 1.17.Mơ hình tương tác QS giữa thực vật và vi khuẩn. Tín hiệu QS AHL (
và ) từ vi khuẩn ( ) ảnh hưởng đến các hoạt động được kiểm sốt bởi QS. Tín hiệu AHL cũng khởi động rất nhiều đáp ứng khác nhau ở thực vật. Thực vật sản xuất và tiết ra các hợp chất AHL mimic ( , ), phá vỡ hoặc biến đổi các hoạt động được điều hịa bởi QS ở vi khuẩn. Đáp ứng của thực vật với các AHL vi khuẩn cĩ thể ảnh hưởng đến sự tiết các hợp chất AHL mimic. AHL mimic từ thực vật cũng cĩ thể ảnh hưởng trở lại sự tổng hợp AHL ở vi khuẩn [31].
+ Quorum sensing trong tương tác vi sinh vật - vi sinh vật
Sự ngăn chặn, phân hủy hoặc tạo ra những phân tử tín hiệu tương tự bởi một quần thể vi sinh vật cĩ thể làm thay đổi tương tác tế bào – tế bào của một quần thể
khác. Chẳng hạn như quần thể vi khuẩn rễ P. aureofaciens tạo ra phenazine để đáp
ứng với các AHL tạo ra bởi các vi khuẩn rễ khác. Bên cạnh các vi khuẩn tạo AHL
(thuộc các chi Erwinia, Rhizobium, Variovorax…), cịn cĩ rất nhiều các vi khuẩn
khác cĩ khả năng phân hủy các tín hiệu AHL này (thuộc các chi Bacillus,
Sphingomonas…). Khơng chỉ cĩ vậy, nhiều vi khuẩn tổng hợp lẫn phân hủy AHL
lại nằm trong cùng một chi (Sphingopyxis spp., A. tumefaciens, P. aeruginosa, V.
Paradoxus). Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa cĩ lời giải thích vì sao một vài vi khuẩn tổng hợp AHL, trong khi đĩ một vài chủng khác cùng lồi lại phân hủy những tín hiệu này [30]. Cơ chế quan trọng cho sự phá vỡ này là sự thủy phân AHL bằng enzyme, cịn gọi là “quorum quenching”. Ở vi khuẩn, cĩ ít nhất hai loại protein liên quan đến sự phân hủy tín hiệu AHL đã được xác định là các acylase
(amidohydrolase) như aiid ở Ralstonia spp., aiia ở một vài lồi thuộc chi Bacillus
spp..(hình 1.18). Hiện nay, vẫn chưa cĩ bằng chứng nào cho thấy thực vật tạo ra và sử dụng những enzyme phân hủy AHL hay những enzyme này cĩ cản trở những vi khuẩn cĩ ích hay khơng nhưng các thực vật mang gen mã hĩa cho các enzyme này
cĩ tính kháng cao đối với bệnh thối nhũn [29]. Chính vì vậy, con đường phá hủy tín
hiệu QS của vi khuẩn cĩ tiềm năng trở thành một cơng cụ hữu hiệu để kiểm sốt bệnh do vi khuẩn ở thực vật [30], [31]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ở Erwinia chrysanthemi 3937 (A470) hệ thống expI/expR sinh tổng hợp ba
loại tín hiệu AHL khác nhau: 3-oxo-C6-AHL, C6-AHL và N-decanoyl-l-
homoserine lactone (C10-AHL). Các tín hiệu này cĩ ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen hrpN, pelE và làm gia tăng mức độ gây bệnh của vi khuẩn Erwinia chrysanthemi 3937 [54]. Bên cạnh đĩ, vi khuẩn Methylobacterium spp. cũng sinh tổng hợp nhiều loại AHL khác nhau trong đĩ cũng cĩ C10-AHL [121]. Vậy, nếu
42
từ vi khuẩn Methylobacterium spp. vượt ngưỡng thì liệu vi khuẩn Erwinia chrysanthemi 3937 cĩ thể gây bệnh cho thực vật được khơng? hay AHL từ vi khuẩn
Methylobacterium spp. cĩ vai trị gì trong quá trình tương tác trên là câu hỏi rất thú vị cần giải đáp.
Hình 1.18. Hiện tượng thối nhũn ở cây Amorphophallus konjac sau khi ủ với vi khuẩn Erwinia carotovora SCG1 sau 5 ngày, CK-: dịng cây khơng được chuyển gen aiiA; D5, D11: hai dịng chuyển nạp thành cơng [29]
1.2.2.2 Cảm ứng hình thành các phản ứng đề kháng ở thực vật
Để chống lại các tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn, virus) thực vật cũng cĩ cả một hệ thống các phản ứng đề kháng. Các nghiên cứu gần đây đang làm sáng tỏ hệ thống này. Mặc dù chưa thể hiểu tường tận các phản ứng đề kháng ở thực vật như ở động vật nhưng những hiểu biết hiện tại cho thấy hệ thống này hoạt động phức tạp và hiệu quả [18]. Bao gồm các phản ứng sau:
- Hình thành các cấu trúc mơ bảo vệ: bao gồm sự gia tăng củng cố vách tế
bào, sự hình thành các Tylose, Gum và đặc biệt là sự hình thành các lớp mơ ngăn cách, mơ biểu bì giúp thực vật cơ lập tác nhân gây bệnh, ngăn chặn sự xâm nhiễm quá mức [18].
- Hình thành các hợp chất hĩa học cĩ tính chất đề kháng như saponin,
- Hình thành phản ứng siêu nhạy cảm (hypersensitive response, HR) là các phản ứng nhanh, diễn ra cục bộ ở vùng bị xâm nhiễm bao gồm các phản ứng oxy hĩa mạnh (ROS, reactive oxygen species), hình thành các gốc ion tự do, phá hủy màng tế bào và sự sinh tổng hợp các chất kháng vi sinh vật [18], [52], [66].
- Phản ứng kháng tập nhiễm (sự kháng mắc phải qua cơ thể [15], systemic
acquired resistance, SAR) là các phản ứng chậm, cĩ tính chất lan truyền qua các cơ quan khác nhau. Liên quan đến salicylic acid và sinh tổng hợp các pathogenis-related (PR) protein, được xem như là các kháng thể ở
thực vật (plantibodies) [18], [28], [52], [66].
- Cảm ứng hình thành hệ thống đề kháng cảm ứng (ISR, induced systemic
resistance). Giống như SAR, ISR cũng giúp thực vật kháng lại các tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên, ISR khơng liên quan đến salicylic acid và pathogenis-related protein mà liên quan tới jamonic acid, ethylene và các hợp chất đề kháng [158].
Các phản ứng trên hầu như khơng diễn ra độc lập trong cơ thể thực vật khi bị tác nhân gây bệnh tấn cơng mà cĩ liên quan chặt chẽ đến nhau chẳng hạn như các phản ứng siêu nhạy cảm khơng chỉ phá hủy các tác nhân gây bệnh và mơ bị tổn thương, mà cịn báo hiệu sự hình thành cấu trúc mơ biểu bì hay tầng rời xung quanh mơ bị tổn hại, tiến tới cơ lập tác nhân gây bệnh và làm lành vết thương [66]. Hình 1.19, minh họa dưới đây cho thấy rõ hơn hệ thống đề kháng ở thực vật.
44
Hình 1.19.Sơ đồ các con đường tín hiệu được hoạt hĩa và sự liên hệ các phản ứng đề kháng ở thực vật. Rp: Protein thụ thể ở thực vật, SOD: superoxide dismutase; ACC: 1-aminocyclopropane-1carboxylic acid; BAG: Benzoic acid glucoside; BA- 2H: benzoic acid-2 hydroxylase; CA: cinnamic acid; cGMP: cyclic guanosine 5’- monophosphate; CHS: chalcone synthase; EFE: enzyme hình thành ethylene; GP: glutathione peroxidase; GST: glutathione S-transferase; HMGR: 3’-hydroxy-3- methylglutaryl-CoA reductase; HO2.: gốc hydroperoxyl; HPDase: hydroxyperoxide dehydrase; MAP:Protein hoạt hĩa mitogen; NO: nitric oxide; OGA và OGA-R: mảnh và thụ thể oligogalacturonide; PAL: phenylalanine amonialyase; PGases: polygalacturonases; PM: màng tế bào chất; SA.: gốc salicylic acid; SAG: salicylic acid glucoside; SIPK và WIPK: salicylic acid và vết thương cảm ứng protein kinase [66]
Khơng chỉ các vi sinh vật gây bệnh mới hoạt hĩa được các phản ứng đề kháng ở thực vật mà các nhĩm vi sinh vật cĩ lợi như PGPR cũng cĩ khả năng này. Được
xem như là những tác nhân kiểm sốt sinh học (biocontrol agent) chúng cĩ khả năng ngăn chặn sự phát triển của bệnh, bảo vệ sức khỏe cây trồng và ngăn chặn dịch bệnh. Về cơ chế, thì ngồi khả năng cạnh tranh về dinh dưỡng, khống chất, nơi cư trú với vi sinh vật gây bệnh, khả năng sinh tổng hợp chất điều hịa tăng trưởng thực vật thì khả năng hoạt hĩa cơ chế phản ứng đề kháng ở thực vật cũng là một yếu tố quan trọng. Trong đa số các trường hợp thì các vi sinh vật gây bệnh cảm ứng hệ