1.1.7.1 Tương tác với thực vật
Giữa cây và vi khuẩn cĩ quan hệ tương hỗ, một số vi khuẩn cĩ lợi cho cây trồng vì chúng tham gia vào các chu trình sinh địa hĩa, cung cấp cho cây các chất dinh dưỡng cần thiết. Đã cĩ rất nhiều cơng trình nghiên cứu về vai trị quan trọng của các vi khuẩn kích thích tăng trưởng ở vùng rễ thực vật (PGPR-Plant Growth Promoting Rhizobacteria), tuy nhiên, tầm quan trọng của hệ vi sinh vật vùng lá vẫn chưa được hiểu rõ. Hầu hết các vi khuẩn sống bám trên bề mặt lá sống hoại sinh dựa vào nguồn cơ chất tiết ra từ dịch lá. Cĩ nhiều loại chất hữu cơ và vơ cơ trong dịch lá, bao gồm tất cả các yếu tố thiết yếu, đường tự do, rượu kết hợp với đường, các amino acid, nhiều acid hữu cơ, chất điều hịa tăng trưởng, vitamine, alkaloid và các hợp chất phenol. Thực tế ở một số rừng mưa nhiệt đới, vi sinh vật cĩ thể tạo thành một lớp dày 50µm trên bề mặt lá nhưng các nghiên cứu lại quan tâm nhiều đến các lồi gây bệnh và ký sinh hơn là các lồi cĩ tác động tích cực. Nguồn thức ăn từ dịch lá tiết ra cĩ lẽ là nguyên nhân của một số vi khuẩn sống cơ hội và trở thành lồi cư trú thường xuyên trên bề mặt thực vật. Liệu cĩ lồi nào trong chúng cung cấp trở lại cho thực vật hay khơng? [69]
Vi khuẩn dinh dưỡng methyl chiếm tỷ lệ lớn trong hệ vi sinh vùng lá của nhiều lồi cây. Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc gây nhiễm vi
khuẩn Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào mơi trường nuơi cấy in
vitro tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mơ thực vật (hình 1.8). Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm vi khuẩn tăng trưởng mạnh hơn so với đối chứng
(số chồi tăng, rễ phát triển mạnh), ngay cả trên mơi trường khơng cĩ vitamine [80], [79].
Hình 1.8. Sự tái sinh chồi của lá cây thuốc lá chuyển gen ipt trên mơi trường MS khơng bổ sung hormone sau một tháng nuơi cấy. (a): khơng bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays. (b): cĩ bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays [80]
PPFM phân bố rộng rãi trên nhiều lồi cây, chúng được phân lập từ hơn 100 lồi thực vật từ địa tiền, rêu cho đến các lồi cây hạt trần và cây hạt kín (hình 1.9). Gần đây cĩ khá nhiều nghiên cứu đã phân lập và khảo sát ảnh hưởng cĩ lợi của vi khuẩn PPFM đối với sự tăng trưởng và sinh lý của thực vật bậc thấp cho tới bậc cao. Mặc dù chưa cĩ bằng chứng tuyệt đối, nhưng các kết quả nghiên cứu đã cho thấy mối quan hệ tương hỗ trong việc vi khuẩn PPFM tận dụng nguồn cơ chất thải ra từ thực vật và ngược lại chúng tiết các hợp chất cĩ hoạt tính sinh học cung cấp trở lại cho cây chủ [50], [69], [87], [92], [93], [100], [104], [115].
Theo Maliti (2000), so với các vi khuẩn liên kết với thực vật khác thì vi khuẩn
Methylobacterium spp. là lồi tồn tại lâu dài và chiếm tỉ lệ lớn nhất khi bề mặt lá được rửa sạch. Holland và cộng sự (1994) đã đề cập đến việc khử trùng thơng
thường trong khâu chuẩn bị nuơi cấy mơ khơng loại trừ được Methylobacterium
18
mẫu mơ này vẫn cĩ nguy cơ bị nhiễm PPFM (hình 1.10). Đây là nhĩm vi khuẩn rất phong phú và khơng gây bệnh thực vật, phân bố chủ yếu ở vùng lá, đặc biệt là những lá non; ngồi ra PPFM cũng sống ở vùng rễ cây và ở các hạt. PPFM chiếm tỉ
lệ lớn và cĩ mật độ từ 104 đến 107 đơn vị khuẩn lạc (cfu: colony-forming unit) trên
mỗi gam trọng lượng tươi của mơ thực vật. Chúng lây nhiễm qua hạt, ở hạt đậu
nành khơ thì mật độ là 105 cfu/gam [69], [104].
Hình 1.9.Sự hiện diện của dịng vi khuẩn PPFM (đã dịng hố gen gfp) trên lá cây cỏ ba lá đỏ (A,B), rễ cây cỏ ba lá (C) và cây lúa mì (D). Mũi tên ở hình A và B biểu thị vi khuẩn nằm sâu trong kẽ lá, s: lục lạp, thanh ngang: A, 40 m; B, 20 m; C, 8
m; D, 20 m [115]
Hình 1.10. P. deltoides _ nigra DN34 tái sinh từ mơ nuơi cấy in vitro trên mơi trường thạch MS. Khuẩn lạc đỏ của Methylobacterium spp. chủng BJ001 cho thấy vi khuẩn phát triển tốt trên mơi trường MS [151]
Tuy PPFM khơng tăng trưởng nhanh như các vi khuẩn vùng lá khác trên mơi trường giàu dinh dưỡng nhưng chúng vẫn cĩ khả năng cạnh tranh tạo khuẩn lạc trên lá. Một số tác giả cho rằng dinh dưỡng methyl tùy ý ở PPFM là một phần lý do duy trì mối quan hệ giữa chúng với thực vật. Bằng cách sử dụng nguồn thức ăn khác thường là methanol, PPFM cĩ thể loại bỏ chất độc này khỏi mơ thực vật và cĩ được chỗ cư ngụ trong lá (mơi trường chỉ thích hợp với một vài lồi vi khuẩn). Việc phân hủy các pectin cĩ methyl cĩ thể tạo một nguồn methanol trong cây. Hoạt động này càng phổ biến ở các mơ đang tăng trưởng [92], [115]. Mặt khác, khi cư ngụ trên thực vật thì methanol khơng phải là nguồn carbon duy nhất cho vi khuẩn
Methylobacterium spp. [142] mà cịn oxalic acid – một sản phẩm bài tiết của thực
vật – cũng là một nguồn carbon cho một vài lồi trong chi Methylobacterium. Tuy
nhiên, khả năng sử dụng chất bài tiết oxalic acid cĩ phải là một cơ chế mới của quá
trình tương tác giữa vi khuẩn Methylobacterium spp. và thực vật hay khơng vẫn
chưa sáng tỏ [129], [130].
Bên cạnh tính phổ biến và tồn tại lâu dài, cịn nhiều bằng chứng cho thấy mặc dù PPFM thu nhận chất dinh dưỡng từ cây chủ nhưng đây khơng phải là mối quan hệ một chiều. Các vi khuẩn này sử dụng nguồn carbon và khống chất từ cây, đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hĩa và chuyển hĩa quan trọng ở cây chủ.
Methylobacterium spp. nổi bật vì nhiều đặc tính quan trọng như khả năng tổng hợp amino acid, PHB (Poly-β-hydroxybutyrate); tổng hợp carotenoid, tăng cường tạo hương vị ở dâu tây; tăng khả năng nảy mầm của hạt; khả năng phân hủy các hợp chất 2,4,6-trinitrotoluene, hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine và nitramine; khả năng phân hủy và chuyển hố một số cơ chất khơng cần thiết ở thực vật thành sản phẩm cĩ giá trị [68], [69], [86], [92], [98], [152], [153], [154], [168].
Tầm quan trọng thực sự của PPFM chính là ở mối quan hệ mật thiết với thực vật. Chủng PPFM đầu tiên được Basile và cộng sự (1969) phát hiện kích thích sinh
trưởng ở cây rêu (Scapania nemorosa) trong điều kiện in vitro. Trong những nghiên
20
rêu nuơi cấy mơ (hình 1.11). Sau đĩ, họ chỉ ra rằng PPFM sản xuất vitamine B12
(cyanocobalamine) và sự bổ sung vitamine này khi trồng rêu Jungermannia
leiantha và Gymnocolea inflata cĩ thể kích thích sự tăng trưởng và phát triển của cây [69], [72], [71], [132].
Hình 1.11.Sự phát triển của rêu Funaria hygrometrica trong điều kiện cĩ vi khuẩn Methylobacterium spp. (+) và đối chứng (-) [71]
Vi khuẩn Methylobacterium spp. cĩ tác động đối với một số lượng lớn các lồi
cây trồng cĩ giá trị như: thuốc lá, hơng, dâu tây, lúa, bơng vải, mía, cà chua, hướng dương, đậu phộng [98], [99], [100], [102], [101], [168]. Tuy nhiên, hiệu quả cho từng loại cây khơng phải do một lồi mà là do sự tác động tổng hợp của nhiều lồi
vi khuẩn Methylobacterium spp. tạo ra [133].
Vi khuẩn Methylobacterium spp. cĩ thể được dùng để kích thích hạt của
những cây quý hiếm, đặc biệt là các lồi cây nhiệt đới. Cĩ thể được sử dụng cho nhiều mục đích khác như giúp phục hồi hạt giống bảo quản, gĩp phần làm tăng năng suất và sản lượng cây trồng, bảo vệ cây tránh các nguy cơ dịch bệnh và cung
cấp các chất chuyển hố cần thiết cho hạt giống [98], [173].
Cây lúa (Oryza sativa) là một loại cây cĩ mối quan hệ mật thiết với các vi
khuẩn PPFM. Nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ vi khuẩn Methylobacterium spp. tác
động tích cực lên sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa cả trong điều kiện in vitro
lẫn ex vitro[97], [104]. Chúng cĩ khả năng làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng
phơi từ mơ sẹo, kích thích tăng trưởng, gia tăng khả năng đẻ nhánh của lúa gĩp phần gia tăng năng suất lúa từ 22,1 đến 24,1%. Ngồi ra, chúng cịn cĩ vai trị ức chế các chủng vi khuẩn gây bệnh trên cây lúa, gĩp phần làm giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17,8-23,7% [100], [104].
Căn cứ vào các cơng trình cơng bố về vi khuẩn Methylobacterium spp. thì các
cơ chế để giải thích mối tương tác giữa chúng và thực vật bao gồm:
a. Chuyển hĩa các chất dinh dưỡng khống cho cây dễ hấp thu. Cơ chế này bao gồm sự tổng hợp các phân tử (như thể sắt-siderophore) làm quá trình hấp thu khống ở cây dễ hơn [77], [160].
b. Tổng hợp các chất điều hịa tăng trưởng thực vật (phytohormone) hay các hợp chất giống phytohormone. Sự sinh tổng hợp cytokinin và auxin ở vi khuẩn
Methylobacterium spp. đã được ghi nhận [49],[69], [68],[89], [92], [114], [148]. c. Tổng hợp và tiết ra enzyme urease, là enzyme cần thiết cho quá trình chuyển hố nitơ ở thực vật [69].
d. Tổng hợp và tiết vitamine B12 hoặc các hợp chất thứ cấp từ PPFM cĩ thể
tăng cường sức sống cho cây con [132].
e. Sinh tổng hợp 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACC deaminase) điều hịa quá trình sinh tổng hợp ethylene, làm giảm thiểu các hiện tượng lão suy ở thực vật [99], [96].
f. Cố định nitơ cung cấp nguồn đạm cho cây [141], [78], [89], [123]. g. Sử dụng các tinh thể oxalate calci [129], [130]
22
Hình 1.12.Giả thuyết về cơ chế tương tác ở mức độ trao đổi các chất chuyển hĩa giữa mơ thực vật và vi khuẩn PPFM [104]
Ngồi khả năng kích thích sự tăng trưởng và phát triển của một số lồi cây
trồng, vi khuẩn Methylobacterium spp. cịn cĩ khả năng ức chế một số vi sinh vật
gây bệnh trên thực vật chẳng hạn như: Xanthomonas camprestris, Pseudomonas
syringae, Erwinia carotovora, Clavibacter michiganense và Agrobacterium tumefaciens, Fusarium solani (gây bệnh trên cây tiêu), Guignardia citricarpa hay
Xylella fastidiosa (gây bệnh nghiêm trọng trên các lồi cây cĩ múi). Madhaiyan ghi nhận khả năng kháng bệnh ở cây lúa và cây đậu phộng cĩ liên quan tới sự thay đổi
hệ enzyme polyphenol trong cây [100], [102]. Penalvera và Poonguzhali ghi nhận
khả năng sinh tổng hợp các phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone, điều này
giúp vi khuẩn Methylobacterium spp. cạnh tranh với các lồi vi khuẩn gây bệnh
khác trong quá trình cư trú trên thực vật [118], [121]. Các nghiên cứu này ghi nhận khả năng giúp cây trồng kháng lại với các tác nhân gây bệnh nhưng chưa làm sáng tỏ các cơ chế. Tuy nhiên, những ghi nhận này cũng cho thấy tiềm năng sử dụng vi
khuẩn Methylobacterium spp. để kiểm sốt dịch bệnh trên thực vật [22], [23], [33], [126].
Cĩ lẽ việc kết hợp tất cả các nguyên nhân nĩi trên làm thay đổi sự sinh trưởng ở những cây nhiễm PPFM. Từ những cơng trình nghiên cứu trước đây, cĩ thể thấy rằng vi khuẩn hiếu khí, dinh dưỡng methyl tùy ý (PPFM) đang ngày càng trở nên hấp dẫn trong nghiên cứu ứng dụng vì chúng tương tác cĩ lợi cho cây trồng.
1.1.7.2 Sản xuất các hợp chất polymer
PHB (Poly-β-hydroxybutyrate) là một loại nhựa polymer chịu nhiệt, là nguồn carbon dự trữ ở vi sinh vật. Do vậy, quá trình sinh tổng hợp hay phân giải hợp chất PHB sẽ do các enzyme cĩ trong sinh vật đảm nhiệm. Do đĩ, PHB được coi như là một loại nhựa sạch, khơng gây ơ nhiễm mơi trường, được áp dụng trong lĩnh vực y dược, nơng nghiệp hay cơng nghiệp thực phẩm. PHB được điều chế thành các sản phẩm cĩ giá trị cao như chỉ khâu dùng trong phẫu thuật, vật liệu gắn kết xương bị gãy, nhựa chịu nhiệt…[166]
Nhiều lồi vi khuẩn cĩ khả năng sinh tổng hợp PHB chẳng hạn như: Bacillus
spp., Ralstonia eutropha, Zoogloea ramigera, Azotobacter beijierinckii,
Methylobacterium spp…. Ở vi khuẩn PHB được tổng hợp theo hai con đường:
Ralstonia eutropha, Zoogloea ramigera, Methylobacterium extorques, PHB được
tổng hợp từ acetyl coenzyme A nhờ quá trình xúc tác bởi 3 enzyme: - ketothiolase,
NADPH-liên kết với Acetoacetyl-CoA reductase và PHB synthase. Trong khi đĩ ở
vi khuẩn Rhodospirillum rubrum và Methylobacterium rhodezianum thì quá trình
sinh tổng hợp PHB chịu tác động của 5 enzyme khác nhau: -ketothiolase,
NADPH-liên kết với Acetoacetyl-CoA reductase, L-(+) crotonase, D-(-) crotonase và PHB synthase [82], [86].
Đa số các lồi vi khuẩn trong chi Methylobacterium đều cĩ khả năng sinh tổng
hợp PHB (hình 1.13) nhưng lượng PHB tạo ra ở mỗi lồi Methylobacterium spp.
24
AM1 trên mơi trường cĩ nguồn carbon là succinate thì lượng PHB tạo thành chiếm 15-20% trọng lượng sinh khối khơ, trong mơi trường cĩ methanol lượng PHB tạo ra
chiếm tới 80% trọng lượng khơ và Methylobacterium fujisawaense trên mơi trường
glucose chỉ sinh tổng hợp được lượng PHB chiếm khoảng 12,4% [166], [175].
Hình 1.13.Cấu trúc phân nhánh của tế bào Methylobacteium extorquens (A) và phân bố của PHB trong tế bào (B) [63]
Trong tế bào vi khuẩn, PHB được dự trữ trong túi bên trong tế bào. PHB bắt màu đặc hiệu với thuốc nhuộm Nile blue, phát ánh sáng đỏ khi được xem dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sĩng 235nm. Một số lồi vi khuẩn thuộc chi
Methylobacterium đã được sử dụng để tách chiết PHB bao gồm: M. extorquens, M. fujisawaense, M. organophilum, M. mesophilicum, M. rhodium, M. rhodesianum,
M. zatmanii, M. radiotolerans [17], [86], [166].
1.1.7.3 Các đặc tính khác
Ngồi khả năng sinh tổng hợp PHB, Methylobacterium spp. cịn cĩ khả năng
sinh tổng hợp một số hợp chất khác cĩ giá trị kinh tế chẳng hạn như: exopolysaccharid được sử dụng để tạo ra các màng sinh học, methylan được sử dụng để tạo ra các polysaccharid ion dương nhằm thay thế cholestyramine dùng trong điều trị bệnh cao huyết áp [90], [159].
Methylobacterium spp. cĩ khả năng sử dụng đa dạng các hợp chất hữu cơ khác nhau, từ các chất khơng độc cho tới các chất độc đối với sinh vật hay các chất gây ơ nhiễm mơi trường (methyl bromine, methyl chloride, methane, trinitrotoluent, Hg, Ni, Cd...). Do vậy, đây là nhĩm vi khuẩn cĩ nhiều tiềm năng để ứng dụng trong xử lý ơ nhiễm mơi trường [45], [63], [73], [107], [152].
M. radiotolerans, M. extorquens, M. fujisawaense cịn cĩ khả năng kháng mạnh với các chất phĩng xạ, chúng vẫn tồn tại ở liều chiếu xạ 20kGy. Vì thế, nhĩm vi khuẩn này được sử dụng làm vi sinh vật chỉ thị cho khả năng vơ trùng của các vật dụng dùng trong ngành cơng nghiệp thực phẩm, y tế được xử lý vơ trùng bằng cơng
nghệ chiếu xạ. Ngồi ra, Methylobacterium spp. cịn cĩ khả năng kháng mạnh với
các chất sát trùng cĩ nguồn gốc Clo, vì thế chúng vẫn tồn tại trong nước uống và
nước sinh hoạt. Do vậy, Methylobacterium spp. cịn được xem như vi sinh vật chỉ
thị cho mức độ ơ nhiễm vi sinh vật của nước [58], [67], [113].
Do sử dụng các hợp chất một carbon làm nguồn năng lượng nên vi khuẩn
Methylobacterium spp. đang là một vi khuẩn kiểu mẫu đầy tiềm năng trong việc sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để sản xuất ra các sản phẩm cĩ giá trị chẳng hạn
như: protein đơn bào, -carotene, vitamine B12, Q10, các amino acid…[63], [139].
Ngày nay, nhiều cơng trình tập trung nghiên cứu vào việc thiết kế các hệ thống vector tái tổ hợp nhằm biểu hiện các protein ngoại lai trong tế bào vi khuẩn
Methylobacterium spp., trong đĩ hai cơng trình nổi bật trong hướng nghiên cứu này là biểu hiện bacteriocin [65] và tinh thể độc tố diệt sâu [43]. Từ những nghiên cứu
này, vi khuẩn Methylobacterium spp. sẽ trở thành vi khuẩn cĩ lợi trong việc tạo ra
các sản phẩm cĩ giá trị cao, phục vụ nơng nghiệp và đời sống [55], [149].
1.1.7.4 Các lồi vi khuẩn Methylobacterium spp. cĩ hại
Khơng phải tất cả các lồi vi khuẩn Methylobacterium spp. là cĩ lợi, một số
lồi Methylobacterium spp. mới được phát hiện cĩ khả năng gây bệnh cho con
người chẳng hạn như lồi M. mesophilicum tồn tại trên thực vật cĩ thể gây dị ứng,
26
Methylobacterium spp. hiện diện trong miệng của người, chuyển hố các hợp chất cĩ chứa lưu huỳnh gây hơi miệng hay gây bệnh hoa chân (foot flora) [21], [20], [131], [135], [169].
Ngồi ra, Methylobacterium spp. cịn phân bố trong hệ thống cung cấp nước
sạch, sự sinh trưởng của chúng trong hệ thống cung cấp nước cĩ thể dẫn tới tắc nghẽn đường ống cấp nước [67].