- Cỏc hạch ruột xuất huyết màu ủỏ xen với màu trắng (gọi là ủỏ hoa võn) Ngoài ra ở thể bệnh món tớnh và thể bệnh phỏt muộn (late onset) thường
2.5.3.Chẩn ủ oỏn huyết thanh học
Hiện nay, ở Việt Nam thường dựng một số phản ứng huyết thanh học sau ủể nghiờn cứu, chẩn ủoỏn và giỏm sỏt bệnh DTL như: thớ nghiệm trung hoà trờn thỏ, phản ứng kết tủa khuếch tỏn trờn thạch, phản ứng ngưng kết giỏn tiếp hồng cầu, phản ứng miễn dịch huỳnh quang, phản ứng miễn dịch ủỏnh dấu enzyme (ELISA), hoỏ mụ miễn dịch (IHC).
2.5.3.1. Phản ứng trung hoà trờn thỏ
Nguyờn lý: virus DTL cường ủộc và virus nhược ủộc cú tớnh gõy bệnh khỏc nhau cho thỏ và cho lợn, nhưng cú tớnh khỏng nguyờn (KN) giống nhau. Cú thể dựng virus DTL cường ủộc tiờm cho thỏ ủể gõy miễn dịch. Sau ủú chứng minh tớnh miễn dịch của thỏ ủối với virus DTL bằng cỏch tiờm virus DTL nhược ủộc [27].
2.5.3.2. Phương phỏp miễn dịch khuếch tỏn trờn thạch
Nguyờn lý: Phản ứng kết tủa khuếch tỏn trờn thạch là phản ứng kết hợp ủặc hiệu giữa KN – KT xảy ra trong mụi trường thạch. Trong thạch KN, KT cỏch nhau một khoảng, chỳng sẽ khuếch tỏn về phớa nhau. Khi KN, KT gặp nhau ở nồng ủộ tương ứng thớch hợp, hiện tượng kết tủa xảy ra. Kết tủa tạo thành một vạch màu trắng trờn mụi trường thạch, cú thể nhận biết bằng mắt thường. Mặc dự ủõy là phản ứng cú tớnh ủặc hiệu cao song do ủộ nhạy quỏ thấp nờn khụng thớch hợp trong chẩn ủoỏn bệnh cũng như nghiờn cứu dịch tễ học.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………23 2.5.3.3. Phản ứng ngưng kết giỏn tiếp hồng cầu
Bỡnh thường virus DTL khụng hấp thụủược trờn bề mặt hồng cầu, vỡ vậy phải xử lớ hồng cầu bằng axit tanic 1%, chất này cú một nhúm chức gắn với hồng cầu một nhúm chức khỏc gắn với virus DTL; khi ủú virus dễ dàng hấp thụ trờn bề mặt hồng cầu cừu, thỏ, chuột lang nhưng khụng gõy ngưng kết hồng cầu. Khi gặp khỏng thể (KT) tương ứng, virus DTL sẽ kết hợp với KT ủú, hồng cầu dớnh lại qua cầu nối KT gõy hiện tượng ngưng kết hồng cầu.
2.5.3.4. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
Nguyờn lý: Dựng KT ủó ủược nhuộm màu huỳnh quang cho tỏc dụng với KN là bệnh phẩm nghi cú chứa virus DTL (hạch, lỏch lợn bệnh) ủó cố ủịnh trờn tiờu bản. Nếu trong bệnh phẩm cú virus DTL, phức hợp KN - KT ủược hỡnh thành. Phức hợp này ủược giữ chặt trờn tiờu bản khụng bị nước rửa trụi. Khi soi trờn kớnh hiển vi huỳnh quang, phức hợp KN - KT sẽ phỏt sỏng (phản ứng dương tớnh). Nếu trong bệnh phẩm khụng cú virus, phức hợp KN - KT sẽ khụng ủược hỡnh thành. KT nhuộm màu huỳnh quang sẽ bị rửa trụi. Khi soi dưới kớnh hiển vi huỳnh, tiờu bản sẽ khụng phỏt sỏng - phản ứng õm tớnh.
2.5.3.5. Phản ứng miễn dịch ủỏnh ủấu enzym (ELISA)
Phản ứng ELISA cú ủộ chớnh xỏc rất cao và tiết kiệm ủược thời gian (chỉ trong vũng 24h).
Hiện nay thường dựng bộ kit Ceditest CSFV cho phản ứng ELISA trực tiếp ủể phỏt hiện virus DTL cú trong mỏu lợn [6].
Nguyờn lý: Dựng bộ kit Ceditest CSFV ủể phỏt hiện khỏng thể trong mỏu lợn. Bộ kit này sử dụng hai khỏng thể ủơn dũng (MAbs), những khỏng thể này nhận biết cỏc Epitop khỏc nhau của khỏng nguyờn E2 nằm trờn lớp vỏ của virus. Bộ kit này dựng ủể phỏt hiện KT khỏng virus DTL trong huyết thanh lợn. KT ủơn dũng thứ nhất (MAb3) ủược gắn lờn ủỏy của cỏc giếng trờn ủĩa phản ứng. KT ủơn dũng thứ 2 ủược gắn men horseradish peroxydase và ủược dựng như conjugate.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………24
Mẫu huyết thanh, conjugate, KN chuẩn ủược cho vào cỏc giếng trờn ủỡa phản ứng và ủở nhiờt ủộ phũng. Sau ủú ủĩa phản ứng ủược rửa ủể loại bỏ cỏc thành phần thừa. Cơ chất ủược bổ sung vào tất cả cỏc giếng. Sau khi ủở nhiệt ủộ phũng, dung dịch dừng phản ứng ủược bổ sung vào tất cả cỏc giếng ủể dừng phản ứng sinh màu. Nếu trong mẫu huyết thanh cú KT khỏng virus DTL thỡ KT này sẽ phản ứng với KN chuẩn. Conjugate sẽ khụng ủược giữ lại trờn ủĩa phản ứng, phản ứng sinh màu khụng xảy ra (phản ứng dương tớnh). Nếu trong huyết thanh khụng cú KT, KN chuẩn sẽ phản ứng với cả hai KT ủơn dũng (conjugate ủược giữ lại trờn ủĩa phản ứng) phản ứng sinh màu sẽ xảy ra (phản ứng õm tớnh).
2.5.3.6. Hoỏ mụ miễn dịch (IHC)
Hoỏ mụ miễn dịch (Immunohistochemistry) là sự kết hợp giữa 2 ngành mụ bệnh học và miễn dịch học. Kỹ thuật IHC ủược dựng khụng những chỉ ủể xỏc dịnh một mụ cú hoặc khụng cú KN ủặc hiệu mà cũn dựng ủể xỏc ủịnh tớnh trạng KN của những tế bào ủặc hiệu trong mụ và vị trớ của KN trong tế bào. Nhờ ủú cú thể xỏc ủịnh ủược dũng tế bào xỏc ủịnh rừ tớnh chất sinh học của quần thể tế bào trong cựng một dũng, và chức năng khỏc nhau của cỏc loại tế bào, thậm chớ cũn cú thể xỏc ủịnh ủược tỏc nhõn gõy bệnh như virus, vi khuẩn. Chỡa khoỏ chớnh trong HMMD là phản ứng ủặc hiệu của KN với KT. Mặc dự ỏp dụng rộng rói với nhiều nguyờn lý khỏc nhau trong nhiều lĩnh vực khỏc nhau, nhưng trong giải phẫu bệnh, HMMD cú tỏc dụng rất lớn và sõu sắc trong việc chẩn ủoỏn giải phẫu bệnh.
Mặc dự ủó cú nhiều tiờu chuẩn mụ bệnh học "cơ bản" dựng cho chẩn ủoỏn, song trong thực tế, sự trựng lặp và giống nhau của cỏc tổn thương, cũng như cú những tổn thương khụng ủiển hỡnh làm cho chẩn ủoỏn mụ bệnh học gặp nhiều khú khăn, khú ủi ủến chẩn ủoỏn xỏc ủịnh hoặc khú thống nhất giữa cỏc nhà giải phẫu bệnh với nhau. Vỡ thế, ủó từ lõu cỏc nhà giải phẫu bệnh trờn thế giới cố gắng tỡm ra nhiều phương phỏp giỳp chẩn ủoỏn phõn biệt như hoỏ mụ học (histochemistry), mụ-enzym học (histoenzymology), miễn dịch huỳnh quang
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………25
(Immunoflourescence), hoỏ mụ miễn dịch (Immunohistochemistry), lai tại chỗ (hybridation in situ)... Hoỏ mụ miễn dịch là kỹ thuật hiện ủại mới ủược ỏp dụng tương ủối rộng rói ở cỏc nước tiờn tiến trờn thế giới vỡ cú ủộ chớnh xỏc cao.