- Sai số của số trung bỡnh (m X): là tham số ủặ c trưng cho sự phõn tỏn của cỏc mẫu quan sỏt ủược ủại diện cho một tổng thể.
4.5.Kết quả ứng dụng kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch vào chẩn ủoỏn bệnh
dịch tả lợn
ðểủỏnh giỏ ủộ nhạy của kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch, ủồng thời kiểm tra sự phõn bố của virus DTL trong cỏc tổ chức của lợn nhiễm bệnh, chỳng tụi tiến hành nhuộm hoỏ mụ miễn dịch với cỏc lỏt cắt ở cỏc mụ khỏc nhau của 10 lợn mắc bệnh. Theo Ramos-Vara J. A., khi cú mặt của virus trong tổ chức ủem làm húa miễn dịch sẽ cho kết quả dương tớnh với sự hiện màu nõu vàng trờn lỏt cắt tổ chức (màu của DAB) [52]. Virus tập trung càng nhiều thỡ sự bắt màu càng rừ, mức dương tớnh càng cao. Với mỗi lụ hoỏ miễn dịch chỳng tụi cú ủối chứng õm là lỏt cắt của lợn khoẻ. Kết quả nhuộm hoỏ miễn dịch ủược trỡnh bày ở bảng 4.7.
Qua bảng 4.7 cho thấy, ở cỏc mụ khỏc nhau cú tỷ lệ dương tớnh khỏc nhau. Ở hạch amygdale, lỏch và hạch màng treo ruột tỷ lệ dương tớnh là 100%. Ở ruột non và gan tỷ lệ dương tớnh là 80%, cũn lại cỏc mụ khỏc cú tỷ lệ dương tớnh thấp hơn, tỷ lệ dương tớnh thấp nhất là ở ruột già 30%. Theo chỳng tụi, nguyờn nhõn của hiện tượng này là do hạch lõm ba và lỏch là ủớch tấn cụng của virus. Virus tăng sinh mạnh ở hạch và lỏch rồi lan sang cỏc cơ quan khỏc. Do ủú tỷ lệ dương tớnh của hạch màng treo ruột, hạch amygdale và lỏch khi nhuộm hoỏ mụ miễn dịch là 100%.
Cỏc mụ khỏc cũng cho tỷ lệ dương tớnh cao là ruột non, gan, thận và phổi với tỷ lệ dương tớnh là từ 50 - 80% số mẫu nghiờn cứu. Theo chỳng tụi cỏc cơ quan này cú tốc ủộ lưu thụng mỏu lớn, hệ thống mạch quản phỏt triển và cú số lượng lớn cỏc tế bào thực bào như: cỏc tế bào lympho ở mảng payer, cỏc ủại thực bào phế nang ở phổi và cỏc tế bào kuffer ở gan... Cỏc tế bào này cú khả năng thực bào rất lớn. Virus nhõn lờn rất nhanh trong nguyờn sinh chất của những tế bào này.
65
Bảng 4.7. Kết quả ứng dụng kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch vào chẩn ủoỏn bệnh dịch tả lợn Mụ nghiờn cứu Số mẫu nghiờn cứu Số mẫu dương tớnh Tỷ lệ dương tớnh (%) Hạch amygdale 10 10 100 Lỏch 10 10 100 Hạch màng treo ruột 10 10 100 Ruột non 10 8 80 Gan 10 8 80 Thận 10 6 60 Phổi 10 5 50 Nóo 10 4 40 Tim 10 4 40 Ruột già 10 3 30
Mặt khỏc khi quan sỏt cỏc tiờu bản nhuộm hoỏ mụ miễn dịch trờn kớnh hiển vi quang học, chỳng tụi thấy sự phõn bố của virus DTL trong cỏc tổ chức như sau:
Ở hạch amygdale, chỳng tụi quan sỏt thấy virus phõn bố rải rỏc khắp vi trường trong cỏc ủại thực bào, tế bào biểu mụ hốc amygdale và tế bào nội màng amygdale.
Ở lỏch, virus phõn bố rải rỏc khắp cỏc vựng tuỷủỏ và tuỷ trắng của lỏch. ðặc biệt virus tập trung cao thành ủỏm lớn bắt màu ủậm của DAB ở cỏc vựng nhồi huyết và trong cỏc ủộng mạch bỳt lụng. Ở vật kớnh 40, virus ủược tỡm thấy trong tế bào ủại thực bào và tế bào lưới nội bỡ.
Ở hạch lympho màng treo ruột, virus phõn bố rải rỏc trong cỏc nang lympho, trong cỏc ủại thực bào và tế bào lympho.
66
Ở ruột non, virus ủược tỡm thấy trong tế bào niờm mạc của ruột và rải rỏc trong cỏc ủại thực bào, tế bào lympho của mảng payer.
Ở gan, virus ủược tỡm thấy rải rỏc trong cỏc tiểu thuỳ gan, trong cỏc tế bào kuffer và tế bào nội mạc của mao quản.
Ở phổi, virus ở trong cỏc tế bào biểu mụ của nhỏnh phổi và cỏc ủại thực bào phế nang.
Ở thận, virus ủược phỏt hiện trong cỏc tế bào ủơn nhõn, tế bào biểu mụ ống lượn và ống gúp.
Ở tim, virus cú trong tế bào nội mạc của mạch quản và số lượng ớt trong tế bào cơ tim.
Ở nóo, virus ủược tỡm thấy rất ớt trong tế bào nội mạc của mạch quản ở vựng cú sự thõm nhiễm cỏc tế bào viờm.
Ở ruột già, tỷ lệ dương tớnh thấp nhất (30%), virus ủược tỡm thấy trong cỏc tế bào niờm mạc của manh tràng.
Như vậy kết quả nhuộm hoỏ mụ miễn dịch ủó cho thấy virus phõn bố và tập trung chủ yếu ở cỏc tổ chức như: hạch amygdale, hạch lympho và lỏch với tỷ lệ xuất hiện 100%. Ở ruột non, gan, thận, virus cũng xuất hiện với tỷ lệ lớn từ 60-80%. Cỏc tổ chức khỏc virus xuất hiện với tỷ lệ thấp hơn.
Qua ủõy cho thấy, khi ứng dụng kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch vào chẩn ủoỏn bệnh DTL chỳng ta nờn lấy mụ bệnh phẩm là hạch amygdale, hạch màng treo ruột và lỏch. Với cỏc mẫu mụ của gan, phổi, ruột non và thận khi làm hoỏ mụ miễn dịch cũng cú ý nghĩa trong chẩn ủoỏn bệnh.
Ngoài ra ủể ủỏnh giỏ mật ủộ tập trung của virus ở cỏc mụ bào, chỳng tụi tiến hành quan sỏt cỏc mẫu tiờu bản nhuộm húa mụ miễn dịch rồi phõn loại ủỏnh giỏ theo mức ủộ bắt màu dương tớnh ở cỏc tiờu bản. Mức ủộ bắt
67
màu dương tớnh của cỏc mẫu tiờu bản sẽ tương ứng với mức ủộ tập trung của virus ở lỏt cắt mụ của tiờu bản ủú.
- Mức ủộ bắt màu dương tớnh nhiều, xuất hiện khắp vi trường: mật ủộ virus tập trung cao (+++).
- Mức ủộ bắt màu dương tớnh vừa phải: mật ủộ virus tập trung mức trung bỡnh (++).
- Mức ủộ bắt màu dương tớnh ớt: mật ủộ virus tập trung ớt (+).
- Khụng cú bắt màu dương tớnh: phản ứng õm tớnh, khụng cú mặt của virus (-). Kết quảủỏnh giỏ mật ủộ tập trung của virus DTL trong cỏc tổ chức ủược trỡnh bày ở bảng 4.8.
Qua bảng 4.8 cho thấy, mật ủộ virus tập trung cao nhất là ở hạch Amygdale, hạch lympho và lỏch. Ở cả 10/10 mẫu chỳng tụi nghiờn cứu ủều phỏt hiện thấy virus.
Tiếp theo cỏc mụ bào cú mật ủộ virus tập trung nhiều như: Ruột non, gan và thận.
Virus tập trung với số lượng ớt ở tim, nóo và ruột già.
Như vậy cú thể kết luận rằng, cỏc mụ bào cú tỷ lệ dương tớnh cao khi nhuộm hoỏ mụ miễn dịch cũng tương ứng sẽ cú mật ủộ virus tập trung nhiều. Ở lợn mắc bệnh dịch tả cỏc tổ chức cú mật ủộ virus tập trung nhiều là: hạch amygdale, hạch lympho, lỏch, ruột non, gan và thận. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
68 Bảng 4.8. Sự phõn bố và mật ủộ của virus DTL trong cỏc cơ quan của lợn mắc bệnh dịch tả Mụ NC Mẫu lợn H ạch Amygdale H ạch lympho Lỏch Gan Ruột
non Thận Phổi Nóo Tim
Ruột già L1 +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ + + + L2 +++ ++ +++ ++ ++ + + + + + L3 ++ + + + + - - - - - L4 +++ ++ ++ + + - - - - - L5 ++ ++ ++ + + ++ + + + - L6 +++ ++ ++ + + + - - - - L7 + + + - - - - L8 ++ + + - - - - L9 +++ ++ ++ ++ + + + - - - L10 +++ +++ ++ ++ ++ ++ + + + +
* Ghi chỳ: (+++): Mật ủộ virus tập trung cao; (++): Mật ủộ virus tập trung vừa phải; (+): Mật ủộ virus tập trung ớt; (-) : Phản ứng õm tớnh khụng cú mặt của virus .
69
ðểủỏnh giỏ ủộ nhạy của kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch, chỳng tụi so sỏnh kết quả làm hoỏ mụ miễn dịch với kết quả chẩn ủoỏn bằng kỹ thuật RT – PCR qua bảng 4.9.
Kỹ thuật RT – PCR ủể chẩn ủoỏn bệnh dịch tả lợn cú nguyờn lý chung là: sử dụng cỏc cặp mồi ủặc hiệu cho những ủoạn RNA ủặc trưng của virus DTL ủể nhõn ủoạn gen ủú lờn với số lượng lớn nhờ mỏy PCR. Sản phẩm thu ủược ủem ủiện di trong mụi trường agarose và ủược so sỏnh với một marker chuẩn. Phản ứng dương tớnh khi vạch ủiện di của mẫu trờn mụi trường agarose trựng với vạch của marker chuẩn.
Trong nghiờn cứu của chỳng tụi 10 mẫu lợn ban ủầu ủó ủược lấy mỏu xột nghiệm xỏc ủịnh dương tớnh với DTL bằng kỹ thuật RT-PCR.
Qua bảng 4.9 cho thấy, kết quả làm hoỏ mụ miễn dịch ở cỏc loại mụ khỏc nhau cho tỷ lệ rất khỏc nhau từ 30-100%.
Ở hạch Amygdale, hạch lympho và lỏch, 100% mẫu nghiờn cứu ủều cho kết quả dương tớnh với virus DTL trựng với kết quả làm RT-PCR. Trong khi ủú ở nóo, tim và ruột già chỉ phỏt hiện 30-40% mẫu cú virus. ðiều này ủược giải thớch là do sự phõn bố khụng ủồng ủều của virus trong cơ thể lợn bệnh. Ở cỏc tổ chức thớch hợp cho virus nhõn lờn và phỏt triển hoặc là ủớch tấn cụng của virus thỡ virus sẽ tập trung nhiều ở ủú với tần suất lớn, ngược lại với cỏc tổ chức ớt tương thớch virus sẽ xuất hiện ớt với tần suất nhỏ.
Như vậy cú thể kết luận, ủộ nhạy của kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch phụ thuộc rất lớn vào việc chọn tổ chức mụ ủem chẩn ủoỏn.
Nghiờn cứu của chỳng tụi cũng cho thấy, khi làm hoỏ mụ miễn dịch ngoài ưu ủiểm quan sỏt ủược sự phõn bố của virus trong cỏc mụ của lợn bệnh, kết quả làm hoỏ mụ miễn dịch ở hạch Amygdale, hạch lympho và lỏch cũng chớnh xỏc tương ủương với kết quả làm RT-PCR.
70
Bảng 4.9. So sỏnh kết quả chẩn ủoỏn bệnh DTL bằng kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch (IHC) với kỹ thuật RT-PCR
Chẩn ủoỏn bằng IHC chẩn ủoỏn bằng RT-PCR H ạch Amygdale H ạch lympho Lỏch Gan Thận Ruột non Ruột
già Phổi Nóo Tim
L1 + + + + + + + + + + + L2 + + + + + + + + + + + L3 + + + + + - + - - - - L4 + + + + + - + - - - - L5 + + + + + + + - + + + L6 + + + + + + + - - - - L7 + + + + - - - - L8 + + + + - - - - L9 + + + + + + + - + - - L10 + + + + + + + + + + + Tỷ lệ % (+) 100% 100% 100% 100% 80% 60% 80% 30% 50% 40% 40% Ghi chỳ:( +): dương tớnh; ( -): õm tớnh
71
Như vậy ủộ nhạy của 2 phương phỏp chẩn ủoỏn trờn là tương ủương nhau. Nhưng ủiều cần chỳ ý là ủộ nhạy của kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch phụ thuộc rất lớn vào việc chọn tổ chức mụ ủem nhuộm. Nờn khi ỏp dụng IHC vào chẩn ủoỏn ở mỗi bệnh phải biết chọn loại mụ thớch hợp nhất nơi cú tỷ lệ tập trung khỏng nguyờn (virus, vi khuẩn...) cao. Với bệnh dịch tả lợn, cỏc mụ cú tỷ lệ virus tập trung cao như: hạch Amygdale, hạch lympho và lỏch. Vỡ vậy khi ứng dụng kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch vào chẩn ủoỏn bệnh dịch tả lợn ủể cú kết quả chớnh xỏc ta nờn chọn mẫu mụ là: hạch Amygdale, hạch lympho và lỏch.
Căn cứ vào những kết quả trờn, cỏc phũng thớ nghiệm cú thể ỏp dụng kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch vào chẩn ủoỏn bệnh DTL với ưu ủiểm là ủộ nhạy cao, dễ làm, chi phớ thấp và khụng cần trang thiết bị hiện ủại.
72
HèNH ẢNH VỀ SỰ PHÂN BỐ VIRUS DTL TRONG MỘT SỐ Mễ
CỦA LỢN MẮC BỆNH KHI NHUỘM HOÁ Mễ MIỄN DỊCH (IHC)
Hỡnh 25: Virus phõn bốở lỏch (x 60) Hỡnh 26: Virus tập trung ởủộng mạch bỳt lụng (x 60) Hỡnh 27: Virus phõn bốở hạch màng treo ruột (x 150)
Hỡnh 28: Virus trong tế bào bạch cầu (x 600)
Hỡnh 29: Virus phõn bốở hạch amygdale
(x 150)
Hỡnh 30: Virus trong tế bào bạch cầu (x 600)
73
Hỡnh 31: Virus phõn bốở ruột (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(x 150)
Hỡnh 32: Virus trong tế bào niờm mạc ruột
(x 600) Hỡnh 33: Virus phõn bốở gan (x 150) Hỡnh 34: Virus phõn bốở thận (x 150) Hỡnh 35: Virus phõn bốở phổi (x 150)
Hỡnh 36: Virus trong ủại thực bào phế nang
74
5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Từ những kết quả nghiờn cứu ủó ủạt ủược, chỳng tụi cú một số kết luận sau:
1. Lợn mắc bệnh dịch tả cú một số triệu chứng lõm sàng ủiển hỡnh như: lợn sốt cao, cú dử mắt, thở khú, tỏo bún, xuất huyết ủiểm ở bốn chõn. Ngoài ra cũn một số triệu chứng khỏc như: ủ rũ, kộm ăn, bỏăn, xuất huyết cỏc vựng da khỏc, ỉa chảy, tớm tai, tớm da, rột run, lợn nằm dồn ủống. Nếu bệnh nặng, lợn cú triệu chứng thần kinh, liệt hai chõn sau.
2. Cỏc tổn thương ủại thể: xuất huyết hạch màng treo ruột, xuất huyết cỏc hạch lympho, tớch nước trong xoang ngực, xoang bao tim và xoang bụng với tỷ lệ rất cao (100%). Xuất huyết ủiểm ở thận, nhồi huyết ở lỏch, sung huyết ở dạ dày - ruột, xuất huyết ở hạch lõm ba là cỏc bệnh tớch ủại thểủặc trưng cho bệnh DTL. Cỏc tổn thương ủại thể khỏc như: loột ở miệng, loột ở hạch amygdale, loột ở ruột già và viờm phế quản phổi, viờm phổi thuỳ cũng xuất hiện trong bệnh DTL.
3. Cỏc tổn thương vi thể chủ yếu ở cỏc cơ quan ruột non, ruột già, phổi, hạch lympho, gan, thận, lỏch, tim và nóo của lợn mắc bệnh dịch tả: sung huyết, xuất huyết, hoại tử tế bào, thoỏi húa tế bào và thõm nhiễm tế bào viờm.
4. Một số chỉ tiờu huyết học cơ bản của lợn mắc bệnh dịch tả:
- Số lượng hồng cầu, hàm lượng huyết sắc tố, tỷ khối huyết cầu, số lượng bạch cầu giảm so với lợn khỏe.
- Tỷ lệ bạch cầu ủa nhõn trung tớnh trong cụng thức bạch cầu tăng cao, trong khi ủú bạch cầu ủơn nhõn lớn và tế bào lympho giảm.
- Hàm lượng protein tổng số, tỷ số A/G giữa lợn mắc bệnh dịch tả và lợn khỏe khụng cú sự khỏc nhau. Hàm lượng Albumin và γ globulin ở lợn mắc bệnh dịch tả thấp hơn so với lợn khỏe.
75
5. Kết quả nhuộm húa miễn dịch cho tỷ lệ dương tớnh cao ở cỏc cơ quan: lỏch, hạch màng treo ruột hạch amygdale, ruột non và gan của lợn mắc bệnh dịch tả.
6. Cú thể ỏp dụng kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch trong chẩn ủoỏn bệnh dịch tả lợn vỡ phương phỏp cú ủộ nhạy cao và cú thể thực hiện ở cỏc phũng thớ nghiệm bệnh lý mà khụng cần cỏc trang thiết bị hiện ủại.
5.2. ðề nghị
Tiến hành ỏp dụng kỹ thuật hoỏ mụ miễn dịch vào chẩn ủoỏn bệnh DTL tại cỏc phũng thớ nghiệm bệnh lý vỡ ủõy là một phương phỏp cú ủộ nhạy cao, dễ làm và chi phớ thấp.
76
TÀI LIỆU THAM KHẢO