Chuột nhắt trắng hay còn gọi là chuột bạch, là động vật phổ biến nhất trong các thí nghiệm về sinh học. Khoảng 40 – 80% động vật được sử dụng trong phòng thí nghiệm là chuột bạch. Với các ưu điểm như kích thước nhỏ, tính nhạy cảm cao và đặc biệt số lượng nhiều sản xuất nhanh mà chi phí thấp hơn nhiều các động vật khác.
25
Tuổi: từ 4–6 tuần
Trọng lượng: 20–25g
Nhiệt độ bình thường: từ 36,5 – 37,50C
Thời gian mang thai: khoảng 20 ngày, mỗi lứa khoảng 11 con.
a. Chăm sóc, nuôi dưỡng chuột trước khi tiêm thí nghiệm
Chuột bạch mua về được nuôi trong các hộp nhựa hình chữ nhật, phía trên nắp được đục lỗ có thể kéo ra vào được. Mỗi ô hộp được lót độn bằng trấu (đã được tiệt trùng ở 1800C trong 30 phút), có thức ăn và nước uống riêng. Nước uống được đựng trong chai nhựa có nắp đậy và có ống thông nhỏ được cắm vào lỗ của nắp hộp để chuột hút nước uống. Trấu thay 1 lần/ngày, nước thay 2 lần/tuần. Chuột được nuôi với khẩu phần khoảng 3 – 5/con/ngày tuỳ theo trọng lượng chuột, cho ăn 2 lần/ngày.
Chuột được chia thành 2 lô (lô Ι và lô ΙΙ), mỗi lô là một hộp nuôi 2 chuột bạch. Hai chuột trong cùng một lô được phân biệt nhau bằng cách dùng mực sơn vào lông trên lưng chuột (biểu thị cho lô Ι) thì tiêm dịch bệnh phẩm chưa qua xử lý nhiệt. Chuột lô ΙΙ để bình thường thì tiêm dịch bệnh phẩm đã qua xử lý nhiệt. Số lượng mẫu thí nghiệm là 50.
Tất cả các chuột thí nghiệm ở 2 lô đều có chung nguồn thức ăn và nước uống, được nuôi dưỡng và chăm sóc trong cùng một điều kiện.
Chuột mới mua về cần nuôi 2 – 3 ngày để thích nghi hoàn cảnh trước khi thí nghiệm.
Hình 3.1. Hộp nuôi chuột bạch
b. Chăm sóc, nuôi dưỡng chuột sau khi tiêm
Sau khi tiêm cần theo dõi 2 – 3 lần/ngày. Trước hết cần chú ý tình hình bên ngoài, sức hoạt động, tư thế hoạt động, ăn uống. Cần xem chuột có chảy nước dãi, nước mắt hay không, chỗ tiêm có bình thường không.
Mỗi chuột thí nghiệm cần phải có phiếu ghi rõ ràng những biểu hiện trước và sau khi tiêm trong suốt thời gian thí nghiệm.
Nếu chuột chết cần chú ý xem tư thế chết, biểu hiện bên ngoài cũng như bệnh tích bên trong (Nguyễn Hữu Hưng, 2006).
26
Hình 3.2. Vị trí đặt hộp nuôi chuột
3.2.3 Phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm để tiêm truyền cho chuột bạch thí nghiệm nghiệm
Mẫu được lấy từ những vịt nghi bệnh “cúm cần” với những triệu chứng liệt chân, liệt cánh, liệt cổ mềm. Nếu vịt còn sống thì huỷ tuỷ, huỷ não hoặc cắt cổ.
Đặt vịt nằm ngửa, dùng cồn 700 sát trùng lông nơi mổ, sau đó dùng kéo cắt da ngay phía trên hậu môn, lột da từ dưới lên trên.
Tiếp theo dùng kéo cắt cơ xoang bụng, sau đó cắt về phía hai bên xương sườn để mở xoang ngực và xoang bụng.
Xem xét bệnh tích các cơ quan nội tạng, sau đó lấy mẫu từ thực quản đến dạ dày cơ (mề) và một phần của ruột non.
Dùng dây thun buột hai đầu: một đầu ở thực quản ngay vị trí hầu và đầu còn lại ở ruột non, sau tá tràng tá tràng một đoạn.
Sau khi phần mẫu được tách rời khỏi cơ thể vịt, dùng cồn 700 sát trùng bên ngoài, rồi để vào dụng cụ đựng mẫu.
Mẫu được trữ lạnh đem về phòng thí nghiệm trong vòng 24h.
3.2.4 Phương pháp tiến hành xử lý mẫu đem tiêm cho chuột thí nghiệm
Mẫu được cắt xuôi theo ống thực quản xuống dạ dày cơ bằng kéo, sau đó dùng muỗng cạo dịch tiêu hoá (và chất chứa trong thực quản nếu có) cho vào ống nghiệm (loại 10ml). Cho thêm nước muối sinh lý 0.9% vào ống nghiệm với tỷ lệ 1:2, để yên ở nhiệt độ thường. Sau 2 giờ, đem đi ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 20 phút. Sau đó, đem lọc với lưới lọc 0,45µm.
Dung dịch bệnh phẩm lọc được đem chia thành 2 phần: một phần đem đi đun cách thuỷ trong 15 phút và phần còn lại không đun thì cho thêm vào 1µl penicillin và 1µl streptomycin để diệt tạp khuẩn.
Tiêm dung dịch bệnh phẩm vào xoang bụng chuột bạch thí nghiệm ở 2 lô (mỗi lô là 1 hộp): lô Ι tiêm dung dịch không đun với liều 0,5ml/con cho 2 chuột. Còn lại lô ΙΙ tiêm dung dịch đã đun 1000C trong 15 phút cho 2 chuột cũng với liều 0,5ml/con. Sau khi tiêm, quan sát chuột thí nghiệm trong 7 ngày.
27
Nếu 2 chuột được tiêm dung dịch (đã đun sôi 1000C trong 15 phút) sống và 2 chuột được tiêm dung dịch không đun chết với các triệu chứng như: ủ rũ – kém vận động, ăn ít hoặc bỏ ăn, liệt cổ, liệt hai chi sau thì chứng tỏ mẫu có chứa độc tố của vi khuẩn C. botulinum (sơ đồ 3.1).
Nếu chuột chết thì tiến hành mổ khám để quan sát bệnh tích của từng cơ quan như: hô hấp (phổi), tuần hoàn (tim), tiêu hoá (dạ dày, ruột non, ruột già), gan, thận, lách. Những biến đổi bệnh tích của từng cơ quan sẽ được ghi nhận trong biên bản mổ khám.
28
Sơ đồ 3.1. Quy trình xử lý mẫu để tiêm truyền trên chuột thí nghiệm
Mẫu vịt (từ hầu đến dạ dày cơ và một phần ruột non)
cắt và cạo dịch bên trong
Dung dịch thu được Cho vào ống nghiệm có chứa
nước muối sinh lý tỷ lệ 1:2
Ly tâm 3000 vòng/phút trong 15
Lọc với giấy lọc tiệt trùng
Không đun, cho vào 1µl penicillin + 1µl streptomycin để yên 2 giờ
Đun ở 1000C trong 15 phút
Tiêm vào xoang bụng 2 chuột (lô ΙΙ) với liều
Nếu 2 chuột lô ΙΙ sống và 2 chuột lô Ι chết với các triệu chứng ủ rũ – kém vận động, liệt cổ, liệt chi sau
Kết quả
Tiêm vào xoang bụng 2 chuột (lô Ι) với liều Theo dõi 7 ngày
Mẫu bệnh phẩm có độc tố botulin Kết luận Chia thành 2 phần
29
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Tổng quan về địa điểm lấy mẫu
Hình 4.1. Một số hình ảnh tại nơi lấy mẫu
Mẫu được tiến hành lấy từ những vịt có triệu chứng liệt cổ, liệt cánh, liệt chân. Vịt được nuôi theo phương thức chạy đồng tại hai địa điểm: huyện Châu Phú và huyện Phú Tân đều thuộc tỉnh An Giang và một số tỉnh khác như: Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Hậu Giang, Kiên Giang và Bến Tre.
Đàn vịt được chăn thả trên các cánh đồng lúa sau khi đã thu hoạch từ tháng 7 – 9/2014. Vịt được cho ăn chủ yếu dựa vào nguồn thức ăn tự nhiên trên đồng như lúa rơi vãi còn sót lại sau thu hoạch, ốc, cá, cua,… Nước uống thì từ sông ngòi kênh rạch có sẵn gần nơi chăn thả chưa qua xử lý. Ngoài ra vịt
30
còn được ăn cho ăn bổ sung thêm các thức ăn hỗn hợp và các loại thuốc bổ. Chuồng vịt được dựng theo kiểu tạm bợ, rào bằng lưới nilon thành ô khép kín, có mái che bằng các tấm nhựa được dựng lên giữa đồng. Lớp độn chuồng được lót bằng rơm và được thay khi bị ướt.
4.2 Kết quả tiêm truyền dịch bệnh phẩm cho chuột bạch
Bảng 4.1 Kết quả khảo sát sau khi tiêm dịch bệnh phẩm cho chuột bạch Số lượng mẫu thí nghiệm Số mẫu gây chết chuột Số mẫu có triệu chứng trên chuột Số mẫu bình thường 50 15 28 7 Tỷ lệ (%) 100 30 56 14
Qua thời gian khảo sát, trong tổng số 50 mẫu đem làm thí nghiệm có 15 mẫu làm chuột chết với các triệu chứng ủ rũ – kém vận động, bỏ ăn, liệt cổ, liệt chi sau chiếm tỷ lệ 30%, chuột có triệu chứng chiếm 28 (56%) mẫu và bình thường là 7 mẫu với tỷ lệ 14%. Điều này cho thấy độc tố botulin có hiện diện trong các mẫu khảo sát và vịt chết là do nhiễm phải độc tố này trong lúc tìm kiếm thức ăn, khu vực chăn nuôi chưa được đảm bảo an toàn.
4.2.1. Triệu chứng của chuột bạch sau khi tiêm truyền dịch bệnh phẩm Bảng 4.2. Số chuột chết và có biểu hiện bất thường ở từng lô sau khi tiêm Bảng 4.2. Số chuột chết và có biểu hiện bất thường ở từng lô sau khi tiêm
Lô Ι (100 con) Tỷ lệ (%) Lô ΙΙ (100 con)
Lô Ι Lô ΙΙ Số chuột chết 23/100 23 0 0/100 Số chuột có biểu hiện bất thường 63/100 63 0 0/100 Số chuột bình thường 14/100 14 100 100/100 Tổng 100/100 100 100 100/100
Qua bảng 4.2 ta thấy, trong 100 chuột khảo sát ở lô Ι thì gồm có chuột chết là 23%, chuột có biểu hiện bất thường là 63% và 14% chuột bình thường. Còn lô ΙΙ (100 chuột) dùng để đối chứng thì không có biểu hiện bất thường hay bất kỳ chuột nào chết, tỷ lệ chuột bình thường là 100%. Kết quả trên ta thấy tỷ lệ chuột chết thấp hơn chuột có biểu hiện bất thường có thể là do những mẫu gây triệu chứng có độc tố ít hơn những mẫu gây chết chuột. Còn 14% chuột bình thường có thể là do những mẫu bệnh phẩm này không có độc tố botulin, bệnh phẩm bị nhiễm bệnh khác không phải do botulin.
31
Bảng 4.3. Một số triệu chứng bất thường của chuột ở lô Ι từ 63 chuột có triệu chứng bất thường ở bảng 4.2 Triệu chứng bất thường Chậm chạp Ủ rũ, kém vận động Đầu nghiêng Liệt chi sau Tiêu chảy Thở bụng Mắt sưng Sợ hãi, dễ giật mình Số chuột biểu hiện (63 con) 46/63 56/63 1/63 1/63 3/63 15/63 7/63 23/63 Tỷ lệ (%) 73,02 88,89 1,59 1,59 4,76 23,81 11,11 36,51
Theo bảng 4.3 trong số 63 (63%) chuột có biểu hiện bất thường ở lô Ι (đã loại trừ chuột chết và bình thường) thì có các triệu chứng nổi bật như: ủ rũ – kém vận động là 56/63 chuột chiếm tỷ lệ cao nhất là 88,89%, kế đến là các triệu chứng chậm chạp 73,02%, sợ hãi dễ giật mình 36%, thở bụng chiếm 23,81%, 11,11% mắt sưng, tiêu chảy thấy được 4,76 và cuối cùng là đầu nghiêng về 1 phía và liệt chi sau cùng chiếm 1,59%. Theo bảng kết quả trên cũng phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới như botulism trên động vật cũng có các đặc điểm lâm sàng cơ bản giống như botulism ở người (Hatheway, 1995). Và mô hình động vật được sử dụng để đánh giá hiệu quả của các kháng độc tố (Middlebrook & Brown, 1995), với liều LD50 trung bình của độc tố botulinum ở khỉ và chuột là 0.4ng/kg (Gill, 1982).
32
4.2.2 Kết quả theo dõi thời gian chuột chết
Bảng 4.4. Bảng theo dõi thời gian chuột chết sau khi tiêm dịch bệnh phẩm Số thứ tự mẫu ruột
(từ 1 đến 50)
Thời gian chuột lô Ι chết (giờ)
Chuột 1 Chuột 2 2 72 – 76 3 144 – 148 6 52 – 56 8 76 – 80 13 14 – 18 14 – 18 23 12 – 16 9, 24, 25, 28 12 – 16 12 – 16 27 12 – 16 30 – 32 29 12 – 16 31 28 – 32 34, 36 28 – 32 28 - 32
Từ bảng 4.4 cho thấy, sau khi tiêm dịch bệnh phẩm vào xoang bụng chuột bạch, sau một thời gian khác nhau thì chuột lô Ι ở một số mẫu chết với các triệu chứng ủ rũ – kém vận dộng, bỏ ăn, liệt cổ, liệt chi sau đặc trưng bởi botulin. Thời gian chuột chết ở mỗi con khác nhau từ 12 – 148 giờ. Sự khác nhau này có thể do lượng độc tố trên mỗi mẫu là khác nhau. Trên cùng một mẫu chuột thứ nhất và thứ hai cũng không chết cùng thời điểm và trên cùng một mẫu có chuột chết có chuột không chết (chuột không chết có triệu chứng bất thường), có thể là do cơ địa mỗi con khác nhau, sức đề kháng và tính mẫn cảm với mầm bệnh cũng khác nhau. Trong mẫu gây chết chuột, có mẫu gây chuột chết thời gian tương đối dài, có thể do lượng độc tố trong mẫu thấp, chuột có sức đề kháng cao làm cho chuột suy kiệt dần rồi chết.
33
4.2.3 Kết quả khảo sát bệnh tích mổ khám trên chuột chết Bảng 4.5 Bảng kết quả khảo sát bệnh tích trên chuột thí nghiệm Bảng 4.5 Bảng kết quả khảo sát bệnh tích trên chuột thí nghiệm
Bệnh tích Số chuột có bệnh tích/số
chuột chết (con)
Tỷ lệ (%)
Tim Xuất huyết 1/23 4,35
Tụ huyết 7/23 30,43 Phổi Xuất huyết 10/23 43,48 Sung huyết 17/23 73,91 Xốp, lốm đốm như hoại tử 1/23 4,35 Mềm bở như viêm dính sườn 1/23 4,35
Gan Xuất huyết 3/23 13,04
Tụ huyết 2/23 8,70 Thận Xuất huyết 1/23 4,35 Dạ dày Đầy 20/23 86,96 Trống 3/23 13,04 Ruột Đầy 22/23 95,65 Trống 1/23 4,35 Bàng quang Tụ huyết 1/23 4,35 Căng 1/23 4,35
Màng treo ruột xuất huyết 1/23 4,35
Hầu hết chuột chết do ngộ độc botulin đều không có bệnh tích đặc trưng, phổ biến là phổi xuất huyết, sung huyết, tim xuất huyết, còn bệnh tích trên các cơ quan khác chiếm tỷ lệ nhỏ.
Kết quả từ bảng trên cho ta thấy, phổi xuất huyết và sung huyết lần lượt chiếm tỷ lệ 43,48% và 73,91%. Tim xuất huyết chiếm 4,35% còn tụ huyết là 30,43%. Các bệnh tích này có thể là nguyên nhân chính gây chết chuột. Mặc dù ta cũng thấy một số bệnh tích khác qua bảng 4.5, nhưng chúng thì không đáng kể hoặc cũng có thể gây chết chuột nhưng với tỷ lệ rất thấp.
Kết quả này phù hợp với mô tả của nhiều tài liệu cho biết hầu hết các trường hợp ngộ độc do độc tố botulin đều không thể hiện bệnh tích đặc trưng. Theo như Jensen and Duncan (1980), khi nghiên cứu về độc tố botulin ở thuỷ cầm hoang dã đã gây nhiễm cho vịt trời bằng độc tố botulin type C, thì thấy hầu hết các trường hợp vịt chết bởi ngộ độc botulin là do liệt hô hấp, xuất huyết, phù phổi, ngoài ra không phát hiện bệnh tích đặc trưng nào. Trường hợp các cơ quan nội tạng khác có bệnh tích có thể là do một vài nguyên nhân khách quan khác trong lúc nhiễm phải độc tố botulin.
34
Từ những triệu chứng lâm sàng quan sát được khi tiến hành lấy mẫu và bệnh tích được khảo sát trong những thí nghiệm, chúng ta có thể xác định bệnh “cúm cần” thường xảy ra trên vịt chạy đồng trong thời gian qua là do nhiễm phải độc tố botulin của vi khuẩn C. botulinum.
Hình 4.5. Một số bệnh tích khi mổ khám chuột chết 4.3 Tỷ lệ nhiễm độc tố của các mẫu theo địa điểm lấy mẫu
Bảng 4.6 Bảng tỷ lệ nhiễm độc tố giữa các địa điểm lấy mẫu vịt được suy ra từ kết quả thí nghiệm trên chuột bạch
Địa điểm Số mẫu
khảo sát Số mẫu Tỷ lệ (%) Gây chết Có triệu chứng Tổng H. Châu Phú 13 4 8 12 92,31 H. Phú Tân 18 4 8 12 66,67 Các tỉnh khác 19 7 10 17 89,47 Tổng 50 15/50 26/50 39/50 Tỷ lệ (%) 100 30 52 78
Theo bảng kết quả mẫu vịt nhiễm độc trên các địa điểm khác nhau thu được, tỷ lệ nhiễm độc tố giữa các địa điểm có sự chênh lệch nhau.
35
CHƯƠNG 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận
Qua thời gian thực hiện thí nghiệm, trong tổng số 50 mẫu khảo sát thì thấy có 15 mẫu gây chết chuột với tỷ lệ 30% và 28 mẫu có biểu hiện bất thường chiếm tỷ lệ 56%, từ đó chúng tôi rút ra được kết luận như sau:
Chuột được tiêm dung dịch bệnh khảo sát chết trong vòng 12 giờ đến 7 ngày với các triệu chứng ủ rũ – kém vận động, bỏ ăn, liệt cổ, liệt chi sau chứng tỏ có độc tố botulin trong dung dịch đem thí nghiệm trên chuột.
Chuột chết nhanh hay chậm có thể do tuỳ thuộc vào lượng độc tố có trong dung dịch đem tiêm, do sức đề kháng của chuột hoặc do cơ địa mỗi chuột.
Chuột tiêm dung dịch bệnh phẩm đã được xử lý nhiệt thì không chết chứng tỏ độc tố đã bị huỷ bằng nhiệt.
Bệnh tích khảo sát được khi chuột chết thường là phổi xuất huyết, sung huyết, tim xuất huyết. Một số trường hợp có xuất hiện các bệnh tích khác có thể do trong lúc trúng độc các chức năng khác bị suy giảm dẫn đến chết. Điều này cho thấy, dùng bệnh tích lâm sàng để xác định bệnh do C. botulinum là rất khó.
Qua thực tế lấy mẫu cũng thấy được tỷ lệ nhiễm bệnh trên đàn vịt không