Chúng tôi tiến hành thử định tính bằng các phản ứng hóa học đặc trưng. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 .Bảng kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ rễ củ loài Trạch Tả
Nhóm chất Thuốc thử Mẫu EtOH n-hexan CHCl3 Flavonoid Shinoda +++ +++ + Diazo ++ ++ + H2SO4 đặc +++ +++ - Tannin Vanilin/HCl (đ) + + + Vanilin +++ +++ + Gelatin/NaCl ++ + + Acetat chì +++ +++ -- Polyphenol NaOH 10% +++ ++ --
24 khác FeCl3 5% ++ ++ + Alkaloid Mayer + + + Dragendroff ++ + + Bouchardat + - - Glycoside Keller-killian +++ ++ + Ghi chú: (-): Không phản ứng (+): Phản ứng (++): Phản ứng mạnh (+++): Phản ứng rất mạnh
Kết quả định tính cho thấy, thành phần trong rễ củ loài Trạch Tả có đầy đủ các nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến như flavonoid, alkanoid, tannin, glycoside…. Trong đó, các phân đoạn ethanol, n-hexan hầu hết đều phản ứng dương tính với các nhóm chất, với mức độ khác nhau. Dựa vào mức đ ộ phản ứng cho thấy cao phân đoạn EtOH , n-hexan phản ứng với các thuốc thử nhận biết flavonoid , tannin và alkaloid mạnh hơn v ới phân đoạn CHCl3. Như vậy , cao phân đoạn EtOH , n- hexan chứa hàm lượn g các chất tự nhiên phong phú hơn phân đoạn CHCl3.
3.2.2. Định lƣợng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp Folin-Ciocalteau.
3.2.2.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
Đường chuẩn gallic acid được xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch gallic acid ở các nồng độ 0; 50; 100; 250; 500; 1000mg/l, tiến hành so màu trên máy
25
quang phổ UV - VIS 1000 ở bước sóng λ=760nm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn gallic acid
STT Gallic acid(mg/l) OD 760nm 1 0 0,031 2 50 0,069 3 100 0,101 4 250 0,238 5 500 0,506 6 1000 1,073
Từ số liệu bảng 3.3 ứng dụng phần mềm Microsoft Excel ta vẽ được đồ thị đường chuẩn gallic acid như hình 3.2 dưới đây:
26
Từ đồ thị cho thấy nồng độ gallic acid từ 50 - 1000 mg/l tỉ lệ thuận với OD do đó dung dịch mẫu để xác định phải nằm trong khoảng này.
3.2.2.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau
Định lượng polyphenol của dịch chiết các phân đoạn bằng phương pháp Folin-Ciocalteau. Dịch chiết mẫu cho phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV - VIS 1000 ở bước sóng λ = 760nm, dùng chất chuẩn là gallic acid để tính lượng polyphenol. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả định lƣợng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết từ rễ củ loài Trạch Tả
Mẫu OD760nm Hàm lƣợng polyphenol (mg/l) Tỷ lệ (%) Cao EtOH 0,442 408 4,08 Cao n-hexan 0,396 362 3,62 Cao CHCl3 0,257 223 2,23
Qua bảng 3.4 ta thấy hàm lượng polyphenol tổng số trong cao EtOH là cao nhất (408 mg/l), các cao phân đoạn n-hexan, CHCl3, lần lượt là 362 mg/l; 223 mg/l.
3.3. Kết quả xác định liều độc cấp
Xác định LD50 của dịch chiết tổng số từ rễ củ Trạch Tả trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp của Lorke [18]. Chuột phải nhịn đói 16 giờ trước khi thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con và được cho uống
27
theo liều tăng dần từ 6500 mg/kg đến 8000 mg/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết từ rễ củ Trạch Tả.
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp theo đƣờng uống
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%
7500mg/kg 10 0 0%
8000mg/kg 10 0 0% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500; 7000; 7500; 8000 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết. Vì vậy chưa tính được LD50, nên chúng tôi có thể kết luận các phân đoạn dịch chiết từ rễ củ loài Trạch Tả hoàn toàn không độc dù là liều rất cao theo đường uống.
3.4. Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm và mô hình ĐTĐ type 2
3.4.1. Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Sự thay đổi khối lượng của các lô chuột thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.3.
28
Bảng 3.6. Khối lƣợng trung bình ( gam)
của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dƣỡng khác nhau.
Nhóm chuột
Ban đầu
Khối lƣợng trung bình của các lô chuột sau mỗi tuần
Tỷ lệ % (sau 6 tuần nuôi so với ban đầu) Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Nhóm ăn thường 18,25 ± 0,57 19,87 ± 0,67 22,96 ± 0,74 25,53 ± 0,76 28,46 ± 0,73 32,13 ± 0,84 35,06 ± 0,96 92,10% Nhóm ăn béo 19,08 ± 0,59 23,79 ± 1,13 29,38 ± 1,28 36,88 ± 1,76 43,15 ± 1,73 49,95 ± 1,74 55,36 ± 1,79 189,98% p>0.05 p<0.05
29
Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn sự tăng khối lượng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng khác nhau trong vòng 6 tuần
Từ bảng 3.6 và đồ thị hình 3.3 ta thấy chuột được nuôi theo chế độ ăn giàu lipid và cholesterol cao có khả năng tăng về khối lượng lớn hơn rất nhiều so với chuột ăn thường và sự sai khác này có ý nghĩa thống kê với trị số p < 0,05.
Sau 6 tuần nuôi, chuột nuôi với thức ăn thường khối lượng cơ thể chỉ tăng thêm 16,81g ứng với 92,10% so với khối lượng ban đầu, trong khi chuột nuôi với thức ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao, khối lượng cơ thể tăng thêm 36,28g ứng với 190,15% so với khối lượng ban đầu. Như vậy, chuột ăn thức ăn béo đã tăng trọng hơn so với chuột ăn thức ăn thường là 19,47g hay gấp 2,16 lần. Đây là kết quả khả quan, phù hợp với thực nghiệm nuôi béo phì dòng chuột nhắt trắng chủng Swiss.
30
Để đánh giá ảnh hưởng của chế độ nuôi béo đến một số chỉ số lipid trong huyết thanh của chuột vào ngày cuối cùng của thời gian nuôi béo sau khi cho nhịn đói qua đêm, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số hoá sinh. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.4 dưới đây.
Bảng 3.7. So sánh một số chỉ số hóa sinh máu giữa nhóm chuột ăn thƣờng và nhóm chuột ăn béo thực nghiệm.
Chỉ số (mmol/l) Nhóm ăn thƣờng Nhóm ăn béo Sự thay đổi % của nhóm ăn béo Cholesterol tổng (TC) 3,46 ± 0,18 5,42* ± 0,24 ↑56,65% Triglycerid (TG) 1,65 ± 0,28 2,41* ± 0,20 ↑46,06% HDL-c 1,46 ± 0,24 0,87* ± 0,18 ↓40,41% LDL-c 0,67 ± 0,48 1,06* ± 0,24 ↑58,21% Glucose 6,18 ± 0,37 8,75* ± 0,38 ↑41,58%
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của các nhóm chuột; (*): p < 0,05 so sánh với nhóm ăn thường)
31
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa nhóm chuột ăn thường và nhóm chuột ăn béo.
Từ bảng số liệu bảng 3.7 và hình 3.4 cho thấy các chỉ số hóa sinh đã có sự khác biệt rất lớn giữa lô nuôi thường và lô nuôi béo. Cụ thể:
Hàm lượng TC trong máu chuột nhóm ăn béo đạt 5,42mmol/l tăng 56,65% so với nhóm nuôi thường. Hàm lượng TG trong máu chuột nuôi béo là 2,41mmol/l tăng 46,06% so với nhóm chuột nuôi thường.
Ở nhóm nuôi béo thì chỉ số HDL-c (0,87mmol/l) có sụt giảm mạnh, giảm tới 40,41% so với chuột nuôi thường (1,46 mmol/l), với p < 0,05. Trái lại, hàm lượng LDL-c trong máu chuột ăn thức ăn béo là 1,06 mmol/l, tăng 58,21% so với nhóm nuôi thường (0,67 mmol/l) với p < 0,05.
Hàm lượng glucose của chuột trong nhóm ăn thức ăn béo là 8,75 mmol/l, tăng 41,58% so với chuột thường (6,18 mmol/l).
32
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với qui luật thực tế và với nghiên cứu của Srinivasan và cộng sự [19]. Điều đó chứng tỏ chuột ăn các thức ăn có hàm lượng lipid cao thời gian dài rất dễ rối loạn trao đổi lipid và glucid.
Cholesterol rất cần thiết trong nhiều quá trình sinh lý của cơ thể và nó là hợp phần cấu tạo của màng tế bào, của các mô thần kinh, các hormon steroid và là tiền chất tổng hợp vitamin D, nhưng khi cholesterol máu tăng cao quá mức lại trở thành có hại vì khi đó nó là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh nguy hiểm như huyết áp cao, xơ vữa động mạch, nhồi máu cơ tim…là những bệnh lý thường gặp ở bệnh nhân béo phì.
TG - Triglycerid hay mỡ trung tính là thành phần chủ yếu của dầu, mỡ động thực vật. Trong thời gian dài chuột luôn có chế độ ăn dư thừa triglycerid nên không những khối lượng tăng mà hàm lượng triglycerid trong máu cũng ứ đọng rất cao. TG cao là nguy cơ độc lập tự nó gây ra bệnh tim mạch, chứng viêm tụy tạng và nếu cùng lúc TG tăng cao, LDL-c tăng cao còn HDL-c giảm thấp thì sự nguy hiểm càng ra tăng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đáng chú ý là sự biến thiên hai chỉ số HDL-c và LDL-c. HDL-c và LDL-c là hai dạng lipoprotein có thành phần giàu cholesterol (lần lượt chứa 18% và ~ 70%) tham gia vào quá trình trao đổi cholesterol của cơ thể theo hai chiều ngược nhau. Đối với LDL-c là “lipoprotein xấu” vì nó vận chuyển cholesterol đến mô để tổng hợp steroid, nó rất dễ bị oxy hoá tạo các hạt LDL-c với kích thước lớn và tỷ trọng thấp là tác nhân gây xơ vữa và làm tắc nghẽn động mạch ở người béo phì, dễ gây nhồi máu cơ tim và đột tử khi gây tắc mạch máu não. Trái lại cholesterol kết hợp với HDL (hight density lipoprotein) ký hiệu là HDL-c được mệnh danh là “lipoprotein tốt” có lợi cho cơ thể chúng chống lại quá trình xơ vữa động mạch bằng cách chuyển cholesterol dư thừa từ trong thành mạch máu trở về gan.
33
Như vậy với sự tăng khối lượng cơ thể, tăng glucose huyết cùng với các chỉ số mỡ máu tăng cao (TC, TG, LDL-c) và giảm HDL-c ở chuột cũng như những hiểu biết về quá trình chuyển hoá lipid, chúng tôi có thể kết luận rằng mô hình gây chuột béo phì bằng các chế độ ăn giàu chất béo đã thành công và tiếp tục sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2. Kết quả tạo mô hình ĐTĐ type 2
Trước khi tiến hành thí nghiệm tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 cho chuột nhịn đói 12 - 16 giờ . Kết hợp giữa chế độ ăn béo trong thời gian 6 tuần và tiêm màng bụng STZ liều đơn 110 mg/kg thể trọng (pha trong đệm Citrat 0,01M ; pH 4,5), chúng tôi đã thành công trong việc gây ĐTĐ type 2 thực nghiệm.
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng glucose huyết những con chuột đã tiêm sau 72 giờ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.8 và hình 3.5 dưới đây:
Bảng 3.8.Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột thí nghiệm trƣớc và sau khi tiêm STZ 72 giờ
Các lô chuột
Nồng độ glucose huyết (mmol/l) Trƣớc khi tiêm Sau khi tiêm 72h
Chuột thường tiêm đệm 6,18 ± 0,21 6,62 ± 0,38(*)
Chuột thường tiêm STZ (110mg/kg) 6,20 ± 0,34 8,20 ± 0,25(**)
Chuột béo phì tiêm đệm 8,35 ± 0,36 8,66 ± 0,45(*)
34
(Ghi chú: (*) Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với p=0,109; 0,752 > 0,05 của chỉ số glucose huyết sau khi tiêm 72h so với thời điểm trước khi tiêm. (**) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 của chỉ số glucose huyết sau khi tiêm 72h so với thời điểm trước khi tiêm).
Hình 3.5. Biểu đồ nồng độ glucose huyết lúc đói
của các lô chuột thí nghiệm trước và sau khi tiêm STZ 72 giờ
Hiện nay, có rất nhiều mô hình ĐTĐ mô phỏng type 2, như mô hình ĐTĐ di truyền, chuột thường ĐTĐ, nhưng mô hình chuột béo phì ĐTĐ vẫn được ưa chuộng nhất bởi vì nó nhiều đặc điểm bệnh lý giống với ĐTĐ type 2 ở người [16]. Tuy nhiên, khả năng gây ĐTĐ type 2 ở chuột tuỳ thuộc nhiều yếu tố như dòng chuột lựa chọn, thời gian và chế độ nuôi béo, liều tiêm STZ. Nhiều công trình khác nhau công bố về hiệu quả mô hình này [10], [15], [16], [17].
Từ kết quả của bảng 3.8 và hình 3.5, ta thấy chuột thường tiêm STZ thì nồng độ glucose huyết thay đổi rất ít . Điều này có thể do chuột ăn thức ăn chuẩn có thể
35
tự điều chỉnh nồng độ glucose huyết nhờ lượng insulin tiết ra điều hoà lượng glucose huyết .
Trong khi đó chuột béo phì tiêm STZ sau 72 giờ có sự thay đổi nồng độ glucose huyết lớn (tăng từ 8,74 mmol/l lên tới 22,52 mmol/l). Điều đó chứng tỏ: những rối loạn về chuyển hóa lipid rất dễ dẫn đến rối loạn về chuyển hóa gluxit.
Kết quả là chúng tôi đã có được lô chuột với nồng độ glucose huyết cao hơn 18 mmol/l chứng tỏ chúng bị ĐTĐ. Kết quả thu được phù hợp với nghiên cứu của tác giả Đỗ Ngọc Liên và cộng sự (2006), Phùng Thanh Hương, Trần Thị Chi Mai và nhiều nghiên cứu khác [11], khi tiến hành gây ĐTĐ bằng STZ trên mô hình chuột béo, đều có glucose huyết tăng cao trên 18 mmol/l.
Từ kết quả trên, có thể suy luận: Những người béo phì, rất nhạy cảm với các chất độc từ môi trường (STZ là một đại diện tiêu biểu trong thí nghiệm), dễ phát triển bệnh ĐTĐ type 2. Việc nuôi béo phì đơn thuần hay tiêm STZ liều thấp đơn thuần ít có khả năng dẫn đến hiện tượng kháng insulin và ĐTĐ type 2. Đây có thể là tác dụng cộng gộp giữa nhiễm độc lipid máu và hóa chất độc từ môi trường bên ngoài.
Như vậy việc kết hợp nuôi béo và tiêm STZ (pha trong đệm Citrat 0,01M ; pH 4,5) liều đơn 110 mg/kg dưới màng bụng [8], [10] là thành công trong mô hình chuột ĐTĐ thực nghiệm mô phỏng theo ĐTĐ type 2.
3.5. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết rễ củ loài Trạch Tả lên chuột ĐTĐ type 2
3.5.1. Tác dụng giảm thể trọng cơ thể chuột
Chúng tôi tiến hành cho các lô chuột ĐTĐ type 2 uống các cao phân đoạn dịch chiết của rễ củ loài Trạch Tả liên tục trong vòng 21 ngày với liều lượng 2000
36
mg/kg thể trọng vào mỗi sáng. Sau đó, so sánh khối lượng trung bình của các lô chuột trước và sau khi điều trị. Kết quả điều trị thu được thể hiện ở bảng 3.9 và hình 3.6.
Bảng 3.9. Khối lƣợng chuột trƣớc và sau khi điều trị bằng các cao phân đoạn từ rễ củ loài Trạch Tả (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lô chuột điều trị
Khối lƣợng (g) Sự thay đổi % sau 21 ngày
điều trị
M0 (g) M
21 (g)
Lô 1 (Bình thường ) 35,06 ± 0,96 37,69 ± 2,14 ↑ 7,50 %
Lô 2 (Không điều trị) 55,88 ± 1,76 63,20 ± 1,52 ↑ 13,10 %
Lô 3 (EtOH) 54,46 ± 1,79 49,22 ± 1,48 ↓ 9,62 %
Lô 4 (n-hexan) 55,25 ± 2,06 50,75± 1,37 ↓ 8,14 %
Lô 5 (CHCl3) 56,34 ± 1,28 52,67 ± 1,65 ↓ 6,51 %
M0: Khối lượng (g) chuột trước khi điều trị
37 35.06 55.88 54.46 55.25 56.34 37.69 63.20 49.22 50.75 52.67 0 10 20 30 40 50 60 70
lô 1 lô 2 lô 3 lô 4 lô 5
Khối lượng (g)
lô chuột
Khối lượng chuột trước khi điều trị Khối lượng chuột sau 21 ngày điều trị
Hình 3.6. Biểu đồ so sánh khối lượng chuột trước và sau 21 ngày điều trị bằng các cao phân đoạn từ rễ củ loài Trạch Tả
Trong đó:
Lô 1: Nuôi bình thường.
Lô 2: ĐTĐ type 2 không điều trị.
Lô 3: ĐTĐ type 2 điều trị bằng cao phân đoạn EtOH 2000 mg/kg.
Lô 4: ĐTĐ type 2 điều trị bằng cao phân đoạn n-hexan 2000 mg/kg.
Lô 5: ĐTĐ type 2 điều trị bằng cao phân đoạn CHCl3 2000 mg/kg.
Từ kết quả bảng 3.9 và hình 3.6 chúng tôi nhận thấy:
Sau 21 ngày điều trị, lô chuột ăn thức ăn thường và lô chuột ĐTĐ type 2 không điều trị mà chỉ cho uống nước thì khối lượng cơ thể tăng lên. Ở lô ăn thức ăn thường tăng 7,5%, lô ĐTĐ type 2 không điều trị tăng 13,10%.
38
Các lô chuột ĐTĐ type 2 có khối lượng cơ thể khá cao nhưng sau khi chúng được điều trị bằng cách cho uống các dịch chiết từ các phân đoạn rễ củ loài Trạch Tả với liều dùng là 2000 mg/kg thể trọng thì kết quả thu được cho thấy khối lượng