(Alisma phantago-aquatica L. ) lên khối lƣợng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột béo phì thực nghiệm
2.3.3.1. Thử độc tính cấp, xác định LD50
Xác định LD50 của dịch chiết từ rễ củ Trạch Tả bằng đường uống theo phương pháp Lorke [18]. Chuột nhịn đói trước 16 giờ thí nghiệm được phân lô ngẫu nhiên N= 10 và cho uống theo liều tăng dần lên đến 8 g/kg (thể tích và khối lượng tối đa cho phép). Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết từ rễ củ Trạch Tả (Alisma phantago-aquatica L.)
2.3.3.2. Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về được chăm sóc ở điều kiện bình thường trong 3- 4 ngày để thích ứng với môi trường mới sau đó chúng tôi tiến hành phân chuột thành hai nhóm với hai chế độ dinh dưỡng như sau:
19
Nhóm 1- Nhóm đối chứng: các con chuột tiếp tục được chăm sóc bằng thức ăn bình thường (do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp).
Nhóm 2- Nhóm nuôi béo: các con chuột được chăm sóc bằng chế độ thức ăn giàu lipid và cholesterol do chúng tôi phối trộn các thực phẩm dinh dưỡng.
Các nhóm chuột được theo dõi trong vòng 6 tuần, khối lượng của các con chuột được kiểm tra hàng tuần. Vào tuần cuối cùng thời gian thí nghiệm, sau khi xác định khối lượng, chúng tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số lipid máu. Các số liệu được thu thập và tiến hành xử lí thống kê.
2.3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ rễ củ Trạch Tả (Alisma phantago-aquatica L.)
Để tìm hiểu tác dụng của dịch chiết rễ củ Trạch Tả lên đường huyết, trước tiên chúng tôi tiến hành gây mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 dựa trên chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với STZ liều đơn của Srinivasan [19].
2.3.4.1. Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2
Để có mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2, chuột nuôi với chế độ ăn giàu chất béo và cholesterol sau 6 tuần, được tiêm màng bụng liều đơn STZ (110 mg/kg pha trong đệm Citrate 0,01M, pH= 4,5).
Đo đường huyết tại các thời điểm 0 giờ (trước khi tiêm STZ), 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ (sau khi tiêm STZ). Đo 3 lần, mỗi lần cách nhau 1 tiếng và lấy giá trị trung bình.Chuột nào có đường huyết cao (≥18 mmol/l) và ổn định được lựa chọn để cho uống cao phân đoạn dịch chiết trong vòng 21 ngày. Đường huyết trong các trường hợp trên đều được đo sau khi cho chuột nhịn qua đêm (12 giờ), chỉ cho uống nước.
20
2.3.4.2. Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết
Các lô chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lô) được ăn thức ăn thường và điều trị hằng ngày bằng cách cho uống cao các phân đoạn dịch chiết. Đường huyết của các con chuột được đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 7, thứ 14, thứ 21 khi điều trị.
21
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ rễ củ Trạch Tả
Để khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên của rễ củ Trạch Tả, chúng tôi tiến hành tách chiết như đã mô tả ở phần phương pháp thu được cao ethanol. Sau đó tiếp tục chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan và chloroform. Kết quả được trình bày trên sơ đồ 3.1 và bảng 3.1.
Hình 3.1. Quy trình chiết suất các phân đoạn dịch chiết từ rễ củ Trạch Tả
Cô loại bỏ dung môi
5000 g Rễ củ Trạch Tả
Ngâm với ethanol 96%, lọc chiết 3 lần
Cao ethanol 298 (g) Trích lại
cao ethanol 50 (g)
Bổ sung nước cất + n –hexan, tỉ lệ (1:1)
Cao n – hexan 97 g Phần còn lại Bổ sung nước cất + CHCl3, tỉ lệ (1:1) Cao CHCl3 31 g
Cô loại bỏ dung môi
Cao phân đoạn nƣớc 60,8 g
22 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ 5000g rễ củ Trạch Tả khô được ngâm kiệt 3 lần trong ethanol 96% tinh khiết ở nhiệt độ phòng, lọc chiết 3 lần liên tiếp, loại dung môi thu được tổng khối lượng mẫu cao cồn tổng số là 298g. Giữ lại 50g dùng cho quá trình phân tích và điều trị cho chuột (chiếm 16,78% tổng khối lượng cao cồn tổng số), khối lượng cao cồn còn lại (248g) tiếp tục tách chiết qua các dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan, chloroform theo quy trình chiết rút trên, thu được 97g cao phân đoạn n- hexan và 31g cao phân đoạn CHCl3.
Từ sơ đồ quy trình tách chiết trên, ta thấy được hiệu suất tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ rễ củ Trạch Tả như sau:
Bảng 3.1. Hiệu suất tách chiết các phân đoạn từ rễ củ Trạch Tả
Phân đoạn Khối lƣợng dịch chiết cô đặc (g)
Hiệu suất chiết rút (% nguyên liệu khô)
Cao ethanol 298 5,96
Cao n-hexan 97 1,94
Cao CHCl3 31 0,62
% Tính theo nguyên liệu khô ban đầu
Hiệu suất chiết rút cao nhất là ở phân đoạn cao ethanol (5,96% so với nguyên liệu khô ban đầu), tiếp đến là cao phân đoạn n-hexan (1,94%), cao phân đoạn chloroform thấp nhất (0,62%). Kết quả này cho thấy trong rễ củ Trạch Tả có chứa số lượng các hợp chất tự nhiên khá phong phú và các cao phân đoạn thu được sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
23
3.2. Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết rễ củ Trạch Tả đoạn dịch chiết rễ củ Trạch Tả
Nhằm góp phần đánh giá thành phần các hợp chất tự nhiên cơ bản có trong các cao phân đoạn từ dịch chiết từ rễ củ Trạch Tả, chúng tôi tiến hành các phản ứng định tính, định lượng.
3.2.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong rễ củ Trạch Tả
Chúng tôi tiến hành thử định tính bằng các phản ứng hóa học đặc trưng. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 .Bảng kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ rễ củ loài Trạch Tả
Nhóm chất Thuốc thử Mẫu EtOH n-hexan CHCl3 Flavonoid Shinoda +++ +++ + Diazo ++ ++ + H2SO4 đặc +++ +++ - Tannin Vanilin/HCl (đ) + + + Vanilin +++ +++ + Gelatin/NaCl ++ + + Acetat chì +++ +++ -- Polyphenol NaOH 10% +++ ++ --
24 khác FeCl3 5% ++ ++ + Alkaloid Mayer + + + Dragendroff ++ + + Bouchardat + - - Glycoside Keller-killian +++ ++ + Ghi chú: (-): Không phản ứng (+): Phản ứng (++): Phản ứng mạnh (+++): Phản ứng rất mạnh
Kết quả định tính cho thấy, thành phần trong rễ củ loài Trạch Tả có đầy đủ các nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến như flavonoid, alkanoid, tannin, glycoside…. Trong đó, các phân đoạn ethanol, n-hexan hầu hết đều phản ứng dương tính với các nhóm chất, với mức độ khác nhau. Dựa vào mức đ ộ phản ứng cho thấy cao phân đoạn EtOH , n-hexan phản ứng với các thuốc thử nhận biết flavonoid , tannin và alkaloid mạnh hơn v ới phân đoạn CHCl3. Như vậy , cao phân đoạn EtOH , n- hexan chứa hàm lượn g các chất tự nhiên phong phú hơn phân đoạn CHCl3.
3.2.2. Định lƣợng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp Folin-Ciocalteau.
3.2.2.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
Đường chuẩn gallic acid được xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch gallic acid ở các nồng độ 0; 50; 100; 250; 500; 1000mg/l, tiến hành so màu trên máy
25
quang phổ UV - VIS 1000 ở bước sóng λ=760nm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn gallic acid
STT Gallic acid(mg/l) OD 760nm 1 0 0,031 2 50 0,069 3 100 0,101 4 250 0,238 5 500 0,506 6 1000 1,073
Từ số liệu bảng 3.3 ứng dụng phần mềm Microsoft Excel ta vẽ được đồ thị đường chuẩn gallic acid như hình 3.2 dưới đây:
26
Từ đồ thị cho thấy nồng độ gallic acid từ 50 - 1000 mg/l tỉ lệ thuận với OD do đó dung dịch mẫu để xác định phải nằm trong khoảng này. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.2.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau
Định lượng polyphenol của dịch chiết các phân đoạn bằng phương pháp Folin-Ciocalteau. Dịch chiết mẫu cho phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV - VIS 1000 ở bước sóng λ = 760nm, dùng chất chuẩn là gallic acid để tính lượng polyphenol. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả định lƣợng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết từ rễ củ loài Trạch Tả
Mẫu OD760nm Hàm lƣợng polyphenol (mg/l) Tỷ lệ (%) Cao EtOH 0,442 408 4,08 Cao n-hexan 0,396 362 3,62 Cao CHCl3 0,257 223 2,23
Qua bảng 3.4 ta thấy hàm lượng polyphenol tổng số trong cao EtOH là cao nhất (408 mg/l), các cao phân đoạn n-hexan, CHCl3, lần lượt là 362 mg/l; 223 mg/l.
3.3. Kết quả xác định liều độc cấp
Xác định LD50 của dịch chiết tổng số từ rễ củ Trạch Tả trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp của Lorke [18]. Chuột phải nhịn đói 16 giờ trước khi thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con và được cho uống
27
theo liều tăng dần từ 6500 mg/kg đến 8000 mg/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết từ rễ củ Trạch Tả.
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp theo đƣờng uống
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%
7500mg/kg 10 0 0%
8000mg/kg 10 0 0%
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500; 7000; 7500; 8000 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết. Vì vậy chưa tính được LD50, nên chúng tôi có thể kết luận các phân đoạn dịch chiết từ rễ củ loài Trạch Tả hoàn toàn không độc dù là liều rất cao theo đường uống.
3.4. Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm và mô hình ĐTĐ type 2
3.4.1. Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Sự thay đổi khối lượng của các lô chuột thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.3.
28
Bảng 3.6. Khối lƣợng trung bình ( gam)
của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dƣỡng khác nhau.
Nhóm chuột
Ban đầu
Khối lƣợng trung bình của các lô chuột sau mỗi tuần
Tỷ lệ % (sau 6 tuần nuôi so với ban đầu) Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Nhóm ăn thường 18,25 ± 0,57 19,87 ± 0,67 22,96 ± 0,74 25,53 ± 0,76 28,46 ± 0,73 32,13 ± 0,84 35,06 ± 0,96 92,10% Nhóm ăn béo 19,08 ± 0,59 23,79 ± 1,13 29,38 ± 1,28 36,88 ± 1,76 43,15 ± 1,73 49,95 ± 1,74 55,36 ± 1,79 189,98% p>0.05 p<0.05
29
Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn sự tăng khối lượng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng khác nhau trong vòng 6 tuần
Từ bảng 3.6 và đồ thị hình 3.3 ta thấy chuột được nuôi theo chế độ ăn giàu lipid và cholesterol cao có khả năng tăng về khối lượng lớn hơn rất nhiều so với chuột ăn thường và sự sai khác này có ý nghĩa thống kê với trị số p < 0,05.
Sau 6 tuần nuôi, chuột nuôi với thức ăn thường khối lượng cơ thể chỉ tăng thêm 16,81g ứng với 92,10% so với khối lượng ban đầu, trong khi chuột nuôi với thức ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao, khối lượng cơ thể tăng thêm 36,28g ứng với 190,15% so với khối lượng ban đầu. Như vậy, chuột ăn thức ăn béo đã tăng trọng hơn so với chuột ăn thức ăn thường là 19,47g hay gấp 2,16 lần. Đây là kết quả khả quan, phù hợp với thực nghiệm nuôi béo phì dòng chuột nhắt trắng chủng Swiss. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
30
Để đánh giá ảnh hưởng của chế độ nuôi béo đến một số chỉ số lipid trong huyết thanh của chuột vào ngày cuối cùng của thời gian nuôi béo sau khi cho nhịn đói qua đêm, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số hoá sinh. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.4 dưới đây.
Bảng 3.7. So sánh một số chỉ số hóa sinh máu giữa nhóm chuột ăn thƣờng và nhóm chuột ăn béo thực nghiệm.
Chỉ số (mmol/l) Nhóm ăn thƣờng Nhóm ăn béo Sự thay đổi % của nhóm ăn béo Cholesterol tổng (TC) 3,46 ± 0,18 5,42* ± 0,24 ↑56,65% Triglycerid (TG) 1,65 ± 0,28 2,41* ± 0,20 ↑46,06% HDL-c 1,46 ± 0,24 0,87* ± 0,18 ↓40,41% LDL-c 0,67 ± 0,48 1,06* ± 0,24 ↑58,21% Glucose 6,18 ± 0,37 8,75* ± 0,38 ↑41,58%
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của các nhóm chuột; (*): p < 0,05 so sánh với nhóm ăn thường)
31
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa nhóm chuột ăn thường và nhóm chuột ăn béo.
Từ bảng số liệu bảng 3.7 và hình 3.4 cho thấy các chỉ số hóa sinh đã có sự khác biệt rất lớn giữa lô nuôi thường và lô nuôi béo. Cụ thể:
Hàm lượng TC trong máu chuột nhóm ăn béo đạt 5,42mmol/l tăng 56,65% so với nhóm nuôi thường. Hàm lượng TG trong máu chuột nuôi béo là 2,41mmol/l tăng 46,06% so với nhóm chuột nuôi thường.
Ở nhóm nuôi béo thì chỉ số HDL-c (0,87mmol/l) có sụt giảm mạnh, giảm tới 40,41% so với chuột nuôi thường (1,46 mmol/l), với p < 0,05. Trái lại, hàm lượng LDL-c trong máu chuột ăn thức ăn béo là 1,06 mmol/l, tăng 58,21% so với nhóm nuôi thường (0,67 mmol/l) với p < 0,05.
Hàm lượng glucose của chuột trong nhóm ăn thức ăn béo là 8,75 mmol/l, tăng 41,58% so với chuột thường (6,18 mmol/l).
32
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với qui luật thực tế và với nghiên cứu của Srinivasan và cộng sự [19]. Điều đó chứng tỏ chuột ăn các thức ăn có hàm lượng lipid cao thời gian dài rất dễ rối loạn trao đổi lipid và glucid.
Cholesterol rất cần thiết trong nhiều quá trình sinh lý của cơ thể và nó là hợp phần cấu tạo của màng tế bào, của các mô thần kinh, các hormon steroid và là tiền chất tổng hợp vitamin D, nhưng khi cholesterol máu tăng cao quá mức lại trở thành có hại vì khi đó nó là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh nguy hiểm như huyết áp cao, xơ vữa động mạch, nhồi máu cơ tim…là những bệnh lý thường gặp ở bệnh nhân béo phì.
TG - Triglycerid hay mỡ trung tính là thành phần chủ yếu của dầu, mỡ động thực vật. Trong thời gian dài chuột luôn có chế độ ăn dư thừa triglycerid nên không những khối lượng tăng mà hàm lượng triglycerid trong máu cũng ứ đọng rất cao. TG cao là nguy cơ độc lập tự nó gây ra bệnh tim mạch, chứng viêm tụy tạng và nếu cùng lúc TG tăng cao, LDL-c tăng cao còn HDL-c giảm thấp thì sự nguy hiểm càng ra tăng.
Đáng chú ý là sự biến thiên hai chỉ số HDL-c và LDL-c. HDL-c và LDL-c là hai dạng lipoprotein có thành phần giàu cholesterol (lần lượt chứa 18% và ~ 70%) tham gia vào quá trình trao đổi cholesterol của cơ thể theo hai chiều ngược nhau. Đối với LDL-c là “lipoprotein xấu” vì nó vận chuyển cholesterol đến mô để tổng hợp steroid, nó rất dễ bị oxy hoá tạo các hạt LDL-c với kích thước lớn và tỷ trọng thấp là tác nhân gây xơ vữa và làm tắc nghẽn động mạch ở người béo phì, dễ gây nhồi máu cơ tim và đột tử khi gây tắc mạch máu não. Trái lại cholesterol kết hợp với HDL (hight density lipoprotein) ký hiệu là HDL-c được mệnh danh là “lipoprotein tốt” có lợi cho cơ thể chúng chống lại quá trình xơ vữa động mạch bằng cách chuyển cholesterol dư thừa từ trong thành mạch máu trở về gan.
33
Như vậy với sự tăng khối lượng cơ thể, tăng glucose huyết cùng với các chỉ số mỡ máu tăng cao (TC, TG, LDL-c) và giảm HDL-c ở chuột cũng như những hiểu biết về quá trình chuyển hoá lipid, chúng tôi có thể kết luận rằng mô hình gây chuột béo phì bằng các chế độ ăn giàu chất béo đã thành công và tiếp tục sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2. Kết quả tạo mô hình ĐTĐ type 2
Trước khi tiến hành thí nghiệm tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 cho chuột