Mục đích:
Nhằm tạo được nguồn bệnh thuần chuẩn sử dụng cho các thí nghiệm sau.
Vật liệu:
- Mẫu bệnh: mẫu bệnh được thu trên lá và trái ở các tỉnh An Giang, Cần Thơ, Tiền Giang.
Phương pháp:
- Mẫu bệnh được đem về phòng thí nghiệm để phân lập, chọn những vết bệnh còn mới, sau đó dùng kéo đã hoặc lưỡi lam được thanh trùng cắt ngay phần tiếp giáp giữa vết bệnh và mô khỏe thành nhiều miếng 5mm2. Sau đó khử trùng bề mặt mẫu bệnh bằng cồn 70% sau đó rửa lại bằng nước cất 3 lần.
- Đặt mẫu bệnh vào đĩa Petri có chứa 20ml môi trường Water agar - Sau 3-4 ngày tiến hành tách ròng.
2.2.2 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng gây bệnh thán thư trên gấc của một số chủng nấm Colletotrichum spp.
Nhằm đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm Collototrichum spp. gây hại trên gấc qua đó xác định chủng gây hại nặng nhất.
Vật liệu:
9 chủng nấm Colletochitrum spp. được thu thập và phân lập từ 3 tỉnh: An Giang, Cần Thơ và Tiền Giang
Cách tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 9 nghiệm thức và 4 lần lặp lại. Nguồn nấm bệnh được nuôi cấy trên môi trường PDA khoảng 10 - 13 ngày ở điều kiện 12 giờ sáng, 12 giờ tối xẽn kẽ, nhiệt độ 250C cho nấm tạo bào tử. Sau đó đem pha loãng để có dung dịch huyền phù đạt mật số bào tử là 106 bào tử/ml
Cây gấc được trồng cho đến khi có từ 3-5 lá sẽ đem phun dung dịch huyền phù, mỗi chậu phun 10ml dịch huyền phù đạt mật số bào tử cho ướt đều cây
Sau khi phun đem các nghiệm thức đặt vào phòng ủ bệnh, phun sương mỗi 2 giờ một lần, cho đến 2 ngày sau thì chuyển ra nhà lưới.
16
Chỉ tiêu theo dõi
Ghi nhận chỉ tiêu qua 5, 7, 11 và 15 NSKC, đánh giá khả năng gây hại của các chủng nấm bằng cách quan sát và ghi nhận phần trăm diện tích vết bệnh.
Số liệu kết quả thí nghiệm được xử lý qua Excel và phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC qua phép thử Duncan
2.2.3 Thí nghiệm 2: Đánh giá hiệu quả ức chế của 10 loại thuốc hóa học lên sự phát triển của chủng nấm Colletotrichum spp. ở điều kiện in vitro.
Mục đích:
Nhằm tìm ra loại thuốc cho hiệu quả cao trong việc phòng trị nấm
Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên gấc.
Vật liệu:
- Nguồn nấm: là chủng nấm Colletotrichum spp. gây hại nặng nhất ở thí nghiệm 1
- 10 loại thuốc hóa học trừ bệnh cây. Mỗi loại được pha với nước cất thanh trùng theo liều lượng khuyến cáo của nhà sản xuất (bảng 2.1)
Bảng 2.1: Các loại thuốc dùng trong thí nghiệm
Tên thuốc Liều lượng khuyến cáo Liều lượng
Antracol 700WP 30 g/8 lít 0,094 g/25ml Amistar 250SC 6 ml/8 lít 0,019 ml/25ml Champion 57,6DP 15 g/8 lít 0,046 g/25ml Daconil 75WP 24 g/8 lít 0,075 ml/25ml Dithane M-45 80WP 28 g/8 lít 0,087 g/25ml Score 250EC 7,5 ml/8 lít 0,023 ml/25ml Topsin M 70%w/w 6 g/8 lít 0,019 g/25ml Anvil 5SC 13,4 ml/8 lít 0,041 ml/25ml Alpine 80WDG 20 g/8 lít 0.062 g/25ml Kasumin 2L 30 ml/8 lít 0.094 ml/25ml
17
Cách tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 10 nghiệm thức với 5 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức là 1 loại thuốc hóa học
Dùng dụng cụ đục các khoanh nấm Colletotrichum spp. (đường kính 5 mm) từ đĩa nấm Nguồn đã chuẩn bị 8 ngày trước đó. Đặt các khoanh nấm lên đĩa Petri chứa 10ml môi trường PDA khoảng 2 ngày trước khi tiến hành thử thuốc. Sau 2 ngày đặt khoanh giấy thấm có tẩm thuốc đối xứng với khoanh nấm Colletotrichum spp. cách thành đĩa 1cm. Trên mỗi đĩa Petri thử nghiệm cho 2 loại thuốc, ghi kí hiệu trên từng đĩa cho từng nghiệm thức.
Chỉ tiêu theo dõi
- Đo khoảng cách vòng vô khuẩn từ mép khuẩn ty phía đặt thuốc đến mép giấy thấm
- Hiệu quả ức chế = Độ hữu hiệu (Moayedi G. And Mostowfizadeh) :
C : Bán kính nấm phát triển về phía không đặt thuốc
T : Bán kính nấm phát triển về phía khoanh giấy thấm có thuốc
Số liệu kết quả thí nghiệm được xử lý qua Excel và phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC qua phép thử Duncan
2.2.4 Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu quả phòng trị của một số loại thuốc hiệu quả đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra trong điều kiện nhà lưới.
Mục đích:
Nhằm tìm ra loại thuốc có hiệu quả phòng trị bệnh cao nhất để ứng dụng phòng trị ngoài đồng.
Vật liệu:
- Nguồn nấm: Là chủng nấm Colletotrichum spp. gây hại nặng nhất ở thí nghiệm 1
- Trái gấc, giống gấc tẻ chín đều, chọn những trái có kích cỡ đều nhau.
- 2 loại thuốc có hiệu quả với nấm Colletotrichum spp. được chọn ở thí nghiệm 2.
C – T
ĐHH (%) = X100
18
Cách tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố với 3 nghiệm thức, trong đó 2 nghiệm thức là 2 loại thuốc và 1 nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức gồm 4 lần lặp lại.
Dùng kim châm tạo 10 vết thương sau 2 mm trên trái theo từng điểm sau đó nhỏ 20 µl trực tiếp lên vết bệnh. Sau đó đặt trái vào bọc ni-lông có chứa gòn thấm nước để giữ ẩm và chuyển các nhiệm thức vào tủ ủ bệnh. Sau 2 ngày nhỏ 2 µl thuốc đã pha theo nồng độ khuyến cáo của nhà sản xuất trực tiếp lên vết bệnh.
Chỉ tiêu theo dõi
Theo dõi và ghi nhận khả năng ức chế vết bệnh dựa trên bán kính của vết bệnh Số liệu kết quả thí nghiệm được xử lý qua Excel và phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC qua phép thử Duncan
19
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả phân lập nấm bệnh
Từ các mẫu được thu thập ở 3 tỉnh: An Giang, Cần Thơ và Tiền Giang, được phân lập và tách ròng xác định được 9 chủng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên gấc (bảng 3.1)
Bảng 3.1: Các chủng nấm được phân lập từ 3 tỉnh An Giang, Cần Thơ và Tiền Giang
Ở ngoài đồng bệnh thán thư xuất hiện cả trên trái và trên lá, xuất hiện rất nhiều vào mùa mưa khi trời nóng có ẩm độ cao. Tại những vườn thu mẫu, do không được cắt tỉa thường xuyên, xung quanh không được thông thoáng nên bệnh xuất hiện rất nhiều. Vết bệnh ngoài đồng hơi lõm, có hình tròn trên lá và bất định trên trái do bị giới hạn bởi gai trái. Vết bệnh khi mới xuất hiện có màu vàng nhạt tâm nâu xám sau chuyển dần sang nâu có tâm sáng và vòng tròn đồng tâm, vết bệnh lớn dần liên kết làm cháy lá. Trên trái bệnh chỉ xuất hiện ở những trái già gần chín (Hình 3.1)
STT Chủng
nấm
Ví trí phân
lập Địa điểm thu mẫu
1 Col-CT1 Lá Long Hưng - Ô môn – Cần Thơ 2 Col-CT2 Lá Long Tuyền – Bình Thủy – Cần Thơ 3 Col-CT3 Lá Long Hưng - Ô môn – Cần Thơ 4 Col-TG1 Trái Bình Trưng - Châu Thành-Tiền Giang 5 Col-TG2 Trái Mỹ Phong – Mỹ Tho – Tiền Giang 6 Col-AG1 Lá Tà Lọt – Tri Tôn – An Giang 7 Col-AG2 Trái Tà Lọt – Tri Tôn – An Giang 8 Col-AG3 Lá An Cư – Tri Tôn – An Giang 9 Col-AG4 Trái An Cư – Tri Tôn – An Giang
20
Hình 3.1: Vết bệnh thán thư ngoài đồng trên trái (A) và lá gấc (B)
3.2 Khả năng gây bệnh thán thư trên gấc của 9 chủng nấm Colletotrichum spp.
Qua kết quả bảng 3.2, cho thấy khả năng gây bệnh của 9 chủng nấm
Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên gấc qua 5, 7, 11 và 15 ngày sau khi chủng bệnh (NSKLB)
Nhìn chung phần trăm diện tích vết bệnh tăng dần ở 5, 7, 11 và 15 NSKLB ở tất cả các chủng nấm. Trong đó chủng Col-CT3 là chủng xuất hiện bệnh sớm và gây hại nặng nhất.
Ở 5NSKLB chỉ có 4 chủng nấm là bắt đầu biểu hiện bệnh là Col-CT1, Col- CT3, Col-AG3 và Col-AG4 tuy nhiên trong đó chủng Col-CT3 gây hại nặng nhất với 13,8% phần trăm diện tích lá bệnh. (Hình 3.2)
Ở 7NSKLB chủng Col-TG2 và Col-AG2 vẫn chưa xuất hiên bệnh trong khi các chủng khác đã gây bệnh. Chủng Col-CT3 vẫn là chủng gây hại nặng nhất với 18,8%.
Ở 11NSKLB tất cả chủng nấm đều biểu hiện bệnh tuy nhiên là rất ít, chỉ có 3 chủng là nhiễm nặng Col-AG3 (26,3%), Col-AG4 (25%) và gây hại nặng nhất có khác biệt là chủng Col-CT3 với (36,3%)
Ở 15NSKLB chủng Col-CT3 cho thấy khả năng gây bệnh nặng hơn so với các chủng còn lại với 56,3%, trong khi đó chủng Col-AG3 và Col-AG4 lượt là 35% và 36,3%
21
Tóm lại, trong 9 chủng nấm Colletotrichum spp. thì chủng Col-CT3 gây bệnh sớm ở 5NSKLB tăng đều qua các ngày đến 15NSKLB với 56,3% là chủng gây hại nặng nhất so với các chủng còn lại. Vì vậy chủng Colletotrichum sp. CT3 được chọn dùng trong các thí nghiệm sau.
Ở 5NSKLB bệnh bắt đầu xuất hiện, vết bệnh có hình tròn hoặc bất định, là một vùng màu vàng nhạt, có tâm ở giữa màu xám đến nâu xám. Ở các ngày tiếp theo, vết bệnh lớn dần ra, các vòng tròn đồng tâm xuất hiện, tâm vết bệnh trở nên nhạt màu. (Hình 3.2)
Bảng 3.2: Phần trăm diện tích lá bệnh vào 5, 7, 11 và 15NSLB nấm Colletotrichum spp.
Ghi chú: Các số trung bình cùng một cột theo sau bởi một hoặc những chử cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Ducan
*: Khác biệt mức ý nghĩa 5% Chủng nấm Phần trăm diện tích lá bệnh (%) 5NSKLB 7NSKLB 11NSKLB 15NSKLB Col-CT1 5,0 b 8,8 cd 13,8 c 18,8 c Col-CT2 0,0 c 5,0 de 6,3 d 12,5 c Col-CT3 13,8 a 18,8 a 36,3 a 56,3 a Col-TG1 0,0 c 5,0 de 6,3 d 17,5 c Col-TG2 0,0 c 0,0 e 5,0 d 10,0 c Col-AG1 0,0 c 5,0 de 13,8 c 28,8 b Col-AG2 0,0 c 0,0 e 5,0 d 16,3 c Col-AG3 5,0 b 11,3 bc 26,3 b 35,0 b Col-AG4 5,0 b 13,8 b 25,0 b 36,3 b Mức ý nghĩa (%) * * * * CV (%) 26,09 42,55 31,18 21,76
22
23
* Đặc điểm hình thái của chủng Colletotrichum sp. CT3.
Nấm Colletotrichum sp. CT3 có sợi nấm màu trắng đến hồng nhạt. Bào tử hình bầu dục hoặc hình trụ hai đầu tròn, màu sáng hồng đến tím hồng, đơn bào, kích thước 10 – 17.5 x 3.5 – 5 µm. Đĩa áp xuất hiện sau 5-6 ngày khi bắt đầu nuôi cấy trên lam, đĩa áp có dạng hình chùy, bầu dục hơi tròn hoặc bất dạng, màu nâu đến nâu đen, kích thước 9 – 15 x 5 - 12.5 µm. Chưa thấy xuất hiện gai cứng. (Hình 3.3)
Hình 3.3 Đĩa áp (A) và bào tử (B) của nấm Colletotrichum sp. CT3 quan sát ở vật kính 40
3.3 Hiệu quả phòng trị của 10 loại thuốc trừ nấm lên sự phát triển của chủng nấm Colletotrichum sp. CT3 trong điều kiện in vitro chủng nấm Colletotrichum sp. CT3 trong điều kiện in vitro
Qua kết quả bảng 3.3 và bảng 3.4 cho thấy khả năng phòng trị của 10 loại thuốc
Colletotrichum sp. CT3 gây bệnh thán thư trên gấc Khi so sánh 10 loại thuốc trừ bệnh với nhau:
* Về bán kính vòng vô khuẩn (BKVVK)
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy, các thời điểm 2, 4, 6 ngày sau khi thí nghiệm (NSKTN) chỉ có 2 loại thuốc thể hiện khả năng ức chế khuẩn ty cao là Topsin M và Score. Trong 8 loại thuốc còn lại có 6 loại thuốc có khả năng phòng trị tương đối đó là AntraCol, Amistar, Champion, Anvil, Dithane và Daconil. Còn Alipne và Kasumin không có ảnh hưởng lẫn hiệu quả với nấm Colletotrichum sp. CT3.
Ở thời điểm 2NSKTN Topsin M và Score 250EC là 2 loại thuốc có khả năng đối kháng tốt nhất với vòng vô khuẩn rõ rệt lần lượt là 12 mm và 9,8 mm. 8 loại thuốc còn lại được ghi nhận là có đối kháng với nấm Colletotrichum sp. CT3. Trong đó Amistar và Dithane cũng có BKVVK tương đối cao với 7,6 mm. Alpine và Kasumin chưa thấy xuất hiện vòng vô khuẩn.
Ở 4NSKTN mặc dùcó giảm nhưng vòng vô khuẩn của thuốc Score 250EC vẫn còn rõ rệt với 7,6 mm, riêng thuốc Topsin M BKVVK vẫn duy trì rõ rệt hầu như
24
không thay đổi với 13,2 mm. Trong khi đó 7 loại thuốc còn lại có BKVVK giảm hoặc biến mất
Ở 6NSKTN Topsin M cho thấy khả năng vượt trội khi BKVVK hầu như không thay đổi với 12,9 mm; Score 250EC có giảm nhưng vẫn còn rõ với 5 mm và 8 loại thuốc còn lại vòng vô khuẩn biến mất hoàn toàn
Qua khảo sát cho thấy trong 10 loại thuốc thì Topsin M có khả năng ức chế tốt nhất, cho hiệu quả ngay từ đâu và kéo dài với bán kính vòng vô khuẩn là 12 mm; 13,2 mm; 12,9 mm tương ứng với 2, 4, 6 NSKTN. Sau đó là thuốc Score 250EC cũng có khả năng ức chế tốt nấm Colletotrichum sp. CT3 với BKVVK lần lượt là 9,8 mm; 7,6 mm; 5 mm tương ứng với 2, 4, 6 NSKTN. Các loại thuốc khác có BKVVK ở 2NSKTN giảm dần và biến mất ở 4 và 6NSKTN.
Ở nghiệm thức thuốc Topsin M, BKVVK xuất hiện ở 2NSKTN và hầu như giữ nguyên không thay đổi cho đến 6NSKTN, qua quan sát từng ngày sợi nấm hầu như không phát triển thêm kể từ 2NSKTN ở rìa khuẩn ty có vành đen có thể do sợi nấm chết tạo nên (Hình 3.4 và 3.5)
Bảng 3.3: BKVVK của 10 loại thuốc đối với nấm Colletotrichum spp. ở các thời điểm 2, 4, 6 ngày sau khi thí nghiệm
Ghi chú: Các số trung bình cùng một cột theo sau bởi một hoặc những chử cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa 5% bằng phép thử Ducan
*: Khác biệt mức ý nghĩa 5%
* Về hiệu quả ức chế (HQƯC)
STT Thuốc BKVVK (mm) 2NSKTN 4NSKTN 6NSKTN 1 Antracol 5,6 de 0,0 d 0,0 c 2 Amisar 7,6 c 2,3 c 0,0 c 3 Champion 6,6 cd 0,0 d 0,0 c 4 Topsin M 12,0 a 13,2 a 12,9 a 5 Anvil 6,8 cd 0,9 d 0,0 c 6 Dithane 7,6 c 0,0 d 0,0 c 7 Score 250EC 9,8 b 7,6 b 5,0 b 8 Daconil 4,6 e 0,0 d 0,0 c 9 Alpine 0,0 f 0,0 d 0,0 c 10 Kasumin 0,0 f 0,0 d 0,0 c Mức ý nghĩa (%) * * * CV (%) 16,83 30,90 28,21
25
Qua bảng 3.4, nhìn chung 10 loại thuốc hóa học có hiệu quả phòng trị đối với nấm Col-CT3, tuy nhiên có chệnh lệch khá cao giữa các loại thuốc. Có hiệu suất đối kháng cao và tốt nhất lần lượt là Topsin M, Score 250EC với hiệu suất tăng liên tục qua 2, 4, và 6NSKTN. 7 Loại thuốc còn lại có HQƯC tăng từ ngày 2 đến ngày thứ 4, tuy nhiên lại giảm khi qua ngày thứ 6, trong đó 2 loại thuốc là Alpine và Kasumin có HQƯC rất thấp, gần như không hiệu quả.
Ở 2NSKTN, một số loại thuốc bắt đầu cho hiệu quả phòng trị nhưng tương đối ít, riêng 2 loại thuốc là Topsin M và Score 250EC là có hiệu suất đối kháng tốt nhất với lần lượt là 34,29% và 21,16%. Các loại thuốc còn lại cho hiệu quả phòng trị chỉ ở mức tương đối, riêng với 3 loại thuốc Daconil, Alpine và Kasumin thì hiệu quả rất ít, hầu như không có tác động đến sự sinh trưởng của nấm.
Ở 4NSKTN, Topsin M và Score 250EC vẫn cho thấy có hiệu quả vượt trội so với các loại thuốc còn lại khi tiếp tục dẫn đầu với HQƯC cao lần lượt là 54,14% và 38,93%. HQƯC của 10 loại thuốc đều tăng tương đối nhiều, cho thấy hiệu quả của các loại thuốc hóa học, tuy nhiên trong đó 2 loại thuốc Alpine và Kasumin có hiệu quả còn thấp. Một số loại thuốc còn lại cho hiệu quả tương đối tốt Antracol (20,31%), Amistar (25,82%), Champion (21,28%), Anvil 5SC (21,3%).
Ở 6NSKTN Topsin M và Score 250EC vẫn có hiệu quả tốt nhất trong 10 loại thuốc với 60,21% (Topsin M) và 40,97% (Score). Hiệu quả của một số loại thuốc bắt đầu giảm như Champion và Anvil 5SC với 21,28% và 21,3% (4NSKTN) giảm