2.1.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian tiến hành thí nghiệm: từ tháng 8 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013. Địa điểm: phòng thí nghiệm Phòng trừ sinh học, Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa
Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
2.1.2 Vật liệu thí nghiệm
Hai loại chuối: chuối già và chuối xiêm được mua tại chợ Tân An (Cần Thơ).
Nguồn nấm Colletotrichum musae được nhận từ Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật,
Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại Học Cần Thơ. Nấm được
nuôi cấy trong đĩa Petri khoảng 10-15 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm.
Nguồn dịch trích: lá Neem (Azadirachta indica) và lá Lược vàng (Callisia
fragrans).
Hóa chất: CaCl2.2H2O
Môi trường được sử dụng trong thí nghiệm
Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) (Atlas, 2004)
Khoai tây 200 g
Đường dextrose 20 g
Agar 20 g
Nước cất 1000 ml
pH 6.7
2.1.3 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị thí nghiệm
Đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, chai thủy tinh, beaker thủy tinh, micropipet, bọc nilon, đèn cồn, đũa cấy, kẹp cấy, thước kẻ, kim mũi giáo, giấy thấm, gòn thấm, kéo, lame, lamelle, lame đếm, băng keo trong, nước cất đã được thanh trùng và sổ ghi chép.
Tủ thanh trùng khô, tủ thanh trùng ướt, tủ cấy, tủ úm, cân điện tử, máy đo pH, kính soi nổi, kính hiển vi, nồi chưng cách thủy, đèn huỳnh quang.
15
2.2 PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp thực hiện gồm có 3 thí nghiệm.
2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng các nồng độ của CaCl2 và dịch trích thực vật đến sự phát triển khuẩn ty nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm
Mục đích thí nghiệm: đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm Colletotrichum musae gây bệnh trên trái chuối sau thu hoạch trong điều kiện
phòng thí nghiệm.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 10 nghiệm thức (Bảng 2.1) với 6 lần lặp lại. Mỗi lần lặp lại của một nghiệm thức là một đĩa Petri chứa môi trường PDA được xử lý một loại dung dịch thí nghiệm ở một nồng độ tương ứng. Nghiệm thức đối chứng là môi trường PDA không có chứa dịch trích thực vật. Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp
của Dhinggra và Sinclair (1995);Mahmud và ctv. (2008); Hajano và ctv. (2012).
Việc lựa chọn dung dịch và nồng độ của dung dịch thí nghiệm được dựa vào
một số kết quả nghiên cứu về CaCl2 và dịch trích thực vật của Phan Thị Hồng Thuý
(2009); Nguyễn Thị Mỹ An (2010).
Bảng 2.1 Nồng độ CaCl2 và dịch trích thực vật được sử dụng trong các thí nghiệm
Số thứ tự Tên thuốc/dịch trích thực
vật
Nồng độ
Nồng độ 1 Nồng độ 2 Nồng độ 3
1 Hóa chất CaCl2 20 mM 40 mM 60 mM
2 Lá Neem 2% 4% 6%
3 Lá Lược vàng 2% 4% 6%
Tiến hành thí nghiệm: lá Neem và lá Lược vàng được thu thập vào buổi sáng sớm, đem rửa sạch bụi bẩn, để cho ráo nước trong khoảng 30 phút. Cân 50 g mỗi loại thực vật nghiền với 50 ml nước cất thanh trùng sau đó rót phần dịch trích qua vải lọc để loại bỏ phần bã, phần dịch trích tiếp tục được lọc qua dụng cụ lọc vi khuẩn có đường kính lỗ lọc 0,2 µm vào một cốc thuỷ tinh đã thanh trùng khô thu được dịch trích với nồng độ 100%. Các nồng độ 2%, 4% và 6% được pha bằng cách lấy lần lượt 2 ml, 4 ml và 6 ml dịch trích hòa tan với 98 ml, 96 ml và 94 ml môi trường PDA.
Môi trường PDA được nấu tan bằng microwave. Sau khi nhiệt độ hạ xuống ở
khoảng 55-60oC (có thể cầm được chai môi trường bằng tay) thì cho dịch trích thực
vật đã chuẩn bị sẵn vào chai môi trường, lắc đều để dịch trích hòa tan vào môi trường rồi đổ vào các đĩa Petri (khoảng 10 ml môi trường/đĩa Petri). Sau khi môi trường đặc lại, đặt các khoanh khuẩn ty nấm đã chuẩn bị vào chính giữa đĩa Petri (Hình 2.2).
16
Cách bố trí trên đĩa
Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thử nghiệm hiệu quả của dịch trích thực vật đối với nấm gây bệnh sau thu hoạch
Chỉ tiêu ghi nhận: ghi nhận đường kính khuẩn lạc của nấm vào các thời điểm 24, 48, 72, 96 và 120 giờ sau đặt khoanh khuẩn ty. Chỉ tiêu được ngừng ghi nhận khi khuẩn lạc của nấm phát triển đến mép đĩa Petri.
Hiệu quả của hóa chất được tính theo công thức:
(ĐKKLđc – ĐKKLi)
HQT (%) = x 100 ĐKKLđc
Trong đó: ĐKKLđc: Đường kính khuẩn lạc của nghiệm thức đối chứng.
ĐKKLi: Đường kính khuẩn lạc của nghiệm thức thuốc i.
Qua kết quả Thí nghiệm 1 sẽ chọn ra các nghiệm thức cho hiệu quả ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm cao nhất để thực hiện cho Thí nghiệm 2 và Thí nghiệm 3.
2.2.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hiệu quả của việc xử lý CaCl2 và dịch trích thực vật sau khi lây bệnh nhân tạo trên trái chuối già và chuối xiêm
Mục đích thí nghiệm: đánh giá hiệu quả của dịch trích lá Neem và dung dịch
CaCl2 trong việc ức chế sự phát triển của nấm C. musae trên hai loại trái chuối xiêm
và chuối già.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức và 12 lặp lại. Mỗi lần lặp lại là một trái chuối được xử lý một loại dung dịch thí nghiệm. Các nghiệm thức thí nghiệm gồm:
- Dịch trích lá Neem 2%.
- Dung dịch CaCl2 20 mM.
- Đối chứng xử lý với nước cất thanh trùng.
Môi trường đã có dịch trích thực vật theo nồng độ tính sẵn Khoanh khuẩn ty nấm gây bệnh
17
Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị trái: chuối được chọn đồng đều về kích thước, màu sắc, rửa sạch bụi
bẩn và ngâm 1 phút bằng cồn 700, sau đó để khô tự nhiên.
Chuẩn bị huyền phù nấm: cho 10 ml nước cất thanh trùng vào đĩa đã cấy nấm, bào tử sẽ được lấy nhẹ nhàng từ bề mặt đĩa Petri bằng lame và huyền phù này được lọc qua 3 lớp vải thưa để loại bỏ sợi nấm thừa. Dùng lame đếm hồng cầu để đếm mật số bào tử trong huyền phù, điều chỉnh bằng cách thêm nước cất hoặc huyền phù
bào tử để đạt mật số 106 bào tử/ml.
Phương pháp lây bệnh nhân tạo: trái được tạo vết thương trên trái bằng cách dùng một bó kim ghim (gồm 9 cây kim) châm lên phần mô trái với độ sâu 3 mm. Dùng ống tiêm (dung tích 5 ml) hút 1 ml huyền phù bào tử nấm tiêm vào những vết thương trên trái. Sau đó, trái được để vào bọc nilon (có tạo ẩm độ bằng gòn thấm nước cất thanh trùng) và buộc chặt lại ủ ở điều kiện 250C (Lê Thị Thúy Hằng, 2012).
Xử lý dịch trích: Sau khi lây bệnh 24 giờ, trái được nhúng vào dịch trích lá Neem 2% và dung dịch CaCl2 20 mM trong 20 giây rồi để trong bọc nilon có bổ sung ẩm độ và ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng (250C). Phương pháp này được thực hiện tương tự Ara và ctv. (2012).
Ghi nhận chỉ tiêu: chiều dài vết bệnh (theo chiều dài trái) ở các thời điểm 4, 5, 6 và 7 ngày sau khi lây bệnh (De Costa và ctv., 2005). Sau đó tính hiệu quả ức chế theo công thức của Yu và ctv. (2012) :
TBCDVBđc - TBCDVBi
HQT (%) = x 100
TBCDVBđc
Trong đó: TBCDVBĐC: trung bình chiều dài vết bệnh của nghiệm thức đối chứng
TBCDVBi: trung bình chiều dài vết bệnh của nghiệm thức thuốc i.
2.2.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu quả của việc xử lý CaCl2 và dịch trích thực vật trước khi lây bệnh nhân tạo trên trái chuối già và chuối xiêm
Mục đích thí nghiệm: ghi nhận hiệu quả của CaCl2 và dịch trích lá Neem trong việc ức chế sự phát triển của nấm bệnh khi mầm bệnh chưa hiện trên hai loại trái chuối xiêm và chuối già.
Bố trí thí nghiệm: tương tự Thí nghiệm 2.
Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị trái và huyền phù bào tử nấm tương tự Thí nghiệm 2.
Cách tiến hành: trái được nhúng vào dịch trích lá Neem 2% và dung dịch CaCl2 20 mM trong 20 giây rồi để trong bọc nilon có bổ sung ẩm độ và ủ ở điều
kiện nhiệt độ phòng (250C). Sau khi nhúng dịch trích được 24 giờ thì tiến hành lây
18
được thực hiện tương tự Sivakumar và ctv. (2002); Yu và ctv. (2012).
Ghi nhận chỉ tiêu: tương tự Thí nghiệm 2.
2.2.4 Xử lý số liệu thống kê
19
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 ẢNH HƯỞNG CỦA CaCl2, DỊCH TRÍCH LÁ NEEM VÀ DỊCH TRÍCH LÁ LƯỢC VÀNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN KHUẨN TY CỦA NẤM
Qua kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của dịch trích lá Neem, lá Lược vàng và
CaCl2 đến sự phát triển của khuẩn ty nấm qua năm thời điểm quan sát (24, 48, 72,
96 và 120 giờ sau khi đặt khoanh khuẩn ty) đã ghi nhận dịch trích lá Neem và CaCl2
với các nồng độ được dùng trong thí nghiệm đều có khả năng làm giảm sự phát triển của khuẩn ty nấm, dịch trích lá Lược vàng không cho hiệu quả cao trong thí nghiệm này (Bảng 3.1).
Ở thời điểm 24 giờ sau khi đặt khoanh khuẩn ty (GSĐKT), các nồng độ khác
nhau từ dịch trích lá Neem, CaCl2 và dịch trích lá Lược vàng nồng độ 2% đều có
khả năng làm giảm sự phát triển của khuẩn ty nấm với đường kính trung bình khuẩn ty từ 8,00-11,17 mm, thấp hơn có ý nghĩa ở mức 5% so với đường kính trung bình khuẩn ty của nghiệm thức đối chứng (12,50 mm). Dịch trích lá Lược vàng ở nồng độ 4% và 6% không có khả năng ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm, với đường kính trung bình khuẩn ty là 12,83 mm. Các nồng độ khác nhau của dịch trích lá
Neem và hóa chất CaCl2 khác biệt không ý nghĩa với nhau (Bảng 3.1).
Ở thời điểm 48 GSĐKT, các nồng độ 2%, 4% và 6% của dịch trích lá Neem
và CaCl2 nồng độ 20 mM có khả năng làm giảm sự phát triển của khuẩn ty nấm với
đường kính trung bình của khuẩn ty từ 21,50-29,67 mm. Ở thời điểm này, dịch trích
từ lá Lược vàng với nồng độ 2%, 4% và 6%, CaCl2 nồng độ 40 mM và 60 mM đều
không có khả năng làm giảm sự phát triển khuẩn ty nấm với đường kính trung bình khuẩn ty từ 33,50-35,00 mm khác biệt không ý nghĩa với đường kính trung bình của khuẩn ty ở nghiệm thức đối chứng (34,00 mm) ở mức ý nghĩa 5% (Bảng 3.1).
Ở thời điểm 72 GSĐKT, dịch trích từ lá Neem vẫn thể hiện khả năng làm giảm sự phát triển của khuẩn ty nấm với đường kính trung bình khuẩn ty là 39,33- 43,33 mm khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (60,00 mm). Ở thời
điểm này, các nồng độ khác nhau của dịch trích lá Lược vàng và CaCl2 được dùng
trong thí nghiệm không thể hiện khả năng làm giảm sự phát triển của khuẩn ty nấm với đường kính trung bình của khuẩn ty từ 58,50 - 63,67 mm. Như vậy, ở thời điểm
này dịch trích lá Neem cho hiệu quả cao và kéo dài hơn so với CaCl2 (Bảng 3.1).
Ở thời điểm 96 GSĐKT, kết quả được ghi nhận tương tự với thời điểm 72 GSĐKT (Bảng 3.1).
Đến thời điểm 120 GSĐKT, dịch trích từ lá Neem (2%, 4% và 6%) vẫn còn thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm. Tuy nhiên, khả năng ức chế này có sự khác nhau giữa các nồng độ. Ở nồng độ 6% thì dịch trích lá Neem
20
cho hiệu quả cao nhất với đường kính trung bình khuẩn ty là 71,83 mm, kế đến là Neem 4% (76,67 mm) và thấp nhất là nồng độ Neem 2% (82,00 mm) (Bảng 3.1).
21
Bảng 3.1 Đường kính (mm) của khuẩn ty nấm Colletotrichum musae trong điều kiện phòng thí nghiệm
Ghi chú: Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5% theo phép thử Duncan; GSĐKT: Giờ sau đặt khuẩn ty
Nghiệm thức Thời điểm quan sát
Dịch trích thực
vật/ hóa chất Nồng độ 24 GSĐKT 48 GSĐKT 72 GSĐKT 96 GSĐKT 120 GSĐKT
Lá Neem 2% 8,83 de 24,33 d 43,33 e 62,67 d 82,00 b 4% 8,50 de 22,33 e 40,67 f 59,17 e 76,67 c 6% 8,00 e 21,50 e 39,33 f 58,50 e 71,83 d Lá Lược vàng 2% 11,17 b 33,50 b 60,33 c 85,67 c 90,00 a 4% 12,83 a 34,83 ab 62,00 b 85,50 c 90,00 a 6% 12,83 a 35,00 a 62,00 b 87,33 b 90,00 a CaCl2.2H2O 20 mM 8,66 de 29,67 c 58,50 d 85,17 c 90,00 a 40 mM 10,00 c 33,83 ab 63,67 a 90,00 a 90,00 a 60 mM 9,17 cd 34,33 ab 63,17 ab 90,00 a 90,00 a Đối chứng 12,50 a 34,00 ab 60,00 cd 84,83 c 90,00 a Mức ý nghĩa * * * * * CV (%) 8,34 3,61 2,36 1,45 0,52
22
Hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm Colletotrichum musae của các loại
dịch trích thực vật và hóa chất được trình bày ở Bảng 3.2.
Ở thời điểm quan sát đầu tiên (24 GSĐKT), các nghiệm thức sử dụng dịch trích lá
Neem và hóa chất CaCl2 có hiệu quả ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm với hiệu
quả ức chế trung bình từ 20,00-35,90% khác biệt không ý nghĩa với nhau và khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng. Dịch trích lá Lược vàng 2%, 4% và 6% cho kết quả không khác biệt với đối chứng ở mức ý nghĩa 5% (Bảng 3.2).
Tại thời điểm 48 GSĐKT, dịch trích lá Neem vẫn cho hiệu quả ức chế nấm tốt
trong khi hiệu quả ức chế nấm của CaCl2 giảm mạnh. Cụ thể là các nồng độ 2%, 4% và
6% dịch trích lá Neem có hiệu quả ức chế nấm cao nhất hiệu quả ức chế trung bình từ
28,34-36,70% và khác biệt không ý nghĩa với nhau; CaCl2 nồng độ 20mM có hiệu quả
ức chế cao thứ hai (12,66%). Tương tự thời điểm trước (24 GSĐKT), dịch trích lá Lược vàng không có khả năng ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm. Ở thời điểm này,
CaCl2 nồng độ 40 mM và 60 mM đã không còn hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty
nấm (Bảng 3.2).
Đến thời điểm 72 GSĐKT, chỉ còn dịch trích từ lá Neem có hiệu quả ức chế nấm với hiệu quả trong khoảng 27,72-34,39%. Các nồng độ 2%, 4% và 6% của dịch trích từ lá Neem khác biệt không ý nghĩa với nhau (Bảng 3.2).
Ở thời điểm 96 GSĐKT, kết quả tương tự thời điểm 72 GSĐKT (Bảng 3.2). Đến thời điểm khảo sát cuối cùng (120 GSĐKT), ba nghiệm thức xử lý dịch trích lá Neem ở nồng độ 2%, 4% và 6% vẫn thể hiện hiệu quả ức chế đối với khuẩn ty nấm (Bảng 3.2).
Như vậy, dịch trích lá Neem (2%, 4% và 6%) có thể ức chế sự phát triển của sợi
nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm, tuy nhiên hiệu quả không cao (<40%). Cả ba
nồng độ này điều cho hiệu quả kéo dài trong bảy ngày, bắt đầu từ lúc 24 GSĐKT. Kết quả này cũng tương tự Hajano và ctv. (2012), dịch trích lá Neem nồng độ 3%, 6% và 12% trong môi trường PDA sẽ cho hiệu quả kiểm soát tốt sự phát triển của sợi nấm
Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa. Dịch trích lá Neem cũng có hiệu quả ức
chế sự phát triển sợi nấm của một số loại nấm Colletotrichum capsici (Nduagu và ctv.,
1997), Alternaria solaniand và Fusarium oxysporum (Hassanein và ctv., 2008),
Colletotrichum lindemuthianum (Amadioha và Obi, 1998), Colletotrichum musae
(Hassan, 2009).
Đối với dung dịch CaCl2 chỉ cho hiệu quả ở thời điểm 24 GSĐKT, cao nhất là
CaCl2 20 mM (>30%), tuy nhiên đến 48 GSĐKT hiệu quả giảm mạnh và không cho
23
rằng Canxi có hoạt động kháng nấm yếu. CaCl2 1-4% không có tác dụng rõ rệt về ức
chế sự tăng trưởng của sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides (Mahmud và ctv.,
2008).
Tuy có thành phần hóa học mang hoạt tính kháng nấm và được nghiên cứu nhiều trong y học nhưng dịch trích lá Lược vàng không thể hiện hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm trong thí nghiệm này.
Nhìn chung dịch trích lá Neem có hiệu quả ức chế nấm tốt hơn và kéo dài hơn so
với dung dịch CaCl2. Dịch trích lá Lược vàng không có hiệu quả ức chế sự phát triển
của khuẩn ty nấm. Các nồng độ Neem 2% và CaCl2 20 mM sẽ được sử dụng để xử lý
cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.2 Hiệu quả ức chế (%) sự phát triển khuẩn ty nấm Colletotrichum musae trong điều kiện phòng thí nghiệm
Nghiệm thức Thời điểm quan sát