a. Mục đích
Nhân mật số tảo và trữ giống tảo thuần. Tăng sinh khối vi tảo Chlorella sp. để chuẩn bị cho thí nghiệm 2
b. Bố trí thí nghiệm
Hình 11. Quá trình nhân giống tảo: (a) 5ml vi tảo trong ống nghiệm, (b) 150ml vi tảo trong bình tam giác có thể tích 250 ml, (c) 500ml vi tảo trong bình tam giác có thể tích 1000ml.
Chuyên ngành công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học15
Chọn mẫu tảo: Chọn ống nghiệm có mật độ tảo tương đối cao và kiểm tra mẫu tảo dưới kính hiển vi, tránh trường hợp mẫu tảo bị nhiễm dòng tảo khác, vi khuẩn hay nấm.
Chuẩn bị 5 ống nghiệm đã khử trùng nhiệt ướt ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút. Chuyển 1ml tảo từ ống tảo gốc vào mỗi ống nghiệm mới có chứa 4ml môi trường BBM.
Đặt 5 ống nghiệm mới đã được chủng tảo vào tủ nuôi tảo ở nhiệt độ phòng, chiếu sáng 24/24 giờ.
Chuyển tổng cộng 25ml từ 5 ống nghiệm đã được nhân giống từ trước vào bình tam giác loại 250ml, có chứa 125ml môi trường BBM đã được khử trùng (thể tích tảo dùng làm mẫu chủng bằng 15-20% thể tích môi trường trong bình chứa mới).
Đặt bình tam giác đã được chủng tảo vào tủ nuôi tảo ở nhiệt độ phòng, chiếu sáng liên tục 24/24 giờ, sục khí liên tục bằng máy sục khí trong 5 ngày.
Sau 5 ngày, chuyển 150ml tảo từ bình tam giác 250ml vào bình tam giác 1000ml chứa 350ml môi trường BBM đã khử trùng.
Tất cả các bình nuôi tảo đều được nuôi ở nhiệt độ phòng, được sục khí ở mức 5ml/s và chiếu sáng liên tục.
c. Phương pháp đếm mật số bằng buồng đếm hồng cầu:
Pha loãng huyền phù tế bào vi sinh vật sao cho trong mỗi ô lớn chỉ từ 10-15 tế bào.
Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào, dùng pippet Pasteur để hút dịch huyền phù này
Đậy buồng đếm bằng 1 phiến kính mỏng.
Nhẹ nhàng dùng đầu col (chứa 10 μl tế bào vi sinh vật), đặt vào cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính mỏng). Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Buồng đếm được chuẩn bị đúng chỉ có vùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được phủ bởi dịch huyền phù tế bào, còn các rãnh chung quanh thì không bị dính ướt.
Chuyên ngành công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học16
Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang. Khi đó, dịch nằm trong khoang có độ dày khoảng 0,1mm.
Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính X10 để tìm buồng đếm. Chỉnh thật rõ. Vi tảo được đếm mật số ở vật kính X10.
Điều chỉnh cường độ ánh sáng để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn các đường kẻ. Tùy vào số lượng tế bào mà có thể chọn cách đếm tất cả các tế bào có trong ô trung tâm hay chỉ đếm các tế bào có trong các ô vuông lớn đại diện. Thông thường, chọn một ô trung tâm và bốn ô nằm ngoài bìa (có đánh dấu X) hoặc 5 ô theo đường chéo ở Hình 10.
Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3-5 phút; phải đếm các tế bào nằm trên hai đường kẻ bên trái và ở trên, còn đường kẻ bên phải và ở dưới thì không đếm (Hình 12)
Hình 12. (a) Buồng đếm hồng cầu với dấu X đỏ là khu vực cần đếm (5 ô). (b) 1 ô nhỏ trong 5 ô và cách đếm tế bào trong ô.
Đếm tất cả các tế bào trong ô vuông đỏ (16x5 ô nhỏ) là đếm đại diện, còn nếu mật số thấp ta đếm hết trong 25 ô.
Công thức tính cho đếm 25 ô là Trong đó N là mật số tế bào/ml.
k là hệ số pha loãng.
a là số tế bào đếm được trong 16x25 ô vuông nhỏ.
Đếm Không đếm k a k a N .10 10 . . 5 .2 16 . . 4000 3 4
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuyên ngành công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học17 3.2.2 Xác định khả năng xử lý nước thải nhà máy chế biến thủy sản của vi tảo
Chlorella sp.
a. Mục đích:
Xác định khả năng xử lý nước thải nhà máy chế biến thủy sản của vi tảo
Chlorella sp., trong đó chú trọng đến khả năng xử lý ô nhiễm đạm và lân. .b. Bố trí thí nghiệm:
Nghiệm thức 1 (NT1): 320 ml nước thải kỵ khí + 80 ml Chlorella sp., nghiệm thức 2 (NT2): 320 ml nước thải tuyển nổi + 80 ml Chlorella sp., đối chứng 1 (ĐT1): 320 ml nước thải kỵ khí + 0 ml vi tảo Chlorella sp., đối chứng 2 (ĐT2): 320 ml nước thải tuyển nổi + 0 ml vi tảo Chlorella sp.. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Bố trí thí nghiệm trong bình nhựa 1 lít, chiếu sáng, sục khí với vận tốc 10mL/s, trong 5 ngày. Ngày 1: Test nước thải đầu vào: COD, tổng đạm, NH4+, NO2-, NO3-, tổng lân, PO43-. Theo dõi chỉ tiêu mật số của tảo hàng ngày bằng buồn đếm hồng cầu. Ngày 6: Thu mẫu: ly tâm, tách bỏ tảo, lấy nước thải (200ml/ mẫu, tổng cộng 9 mẫu), trữ lạnh, gửi mẫu TP5 – AKIZ LAB, kiểm tra lại các chỉ tiêu: COD, tổng đạm, NH4+, NO2-, NO3-, tổng lân, PO43-.
Hình 13. Nước thải đã được chủng vi tảo Chlorella sp, sục khí 10ml/s, chiếu
sáng liên tục.
(Nguồn: Ảnh chụp 04/09/2013)
c. Phương pháp (xử lý) thống kê
Số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics 16.1.18.
Chuyên ngành công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học18
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Tính chất của hai loại nước thải đầu vào.
Hình 14: Hai loại nước thải trước khi xử lý bằng vi tảo Chlorella sp.
(Nguồn: Ảnh chụp 04/09/2013)
Hai loại nước thải sử dụng để nghiên cứu được lấy từ hệ thống xử lý kỵ khí của dự án AKIZ, đặt tại nhà máy thủy sản An Khang – Nam Mỹ (Trà Nóc – Cần Thơ). Loại 1 là nước thải sau khi xử lý tuyển nổi, tách bỏ xương cá, vỏ tôm, và các chất rắn có trong nước thải. Loại 2 là nước thải đã được xử lý bằng phương pháp kỵ khí (Hình 14). Thành phần các chất có trong hai loại nước thải được liệt kê trong bảng 2.
Hàm lượng NH4+ trong nước thải tuyển nổi là 427,90 mg/L, nhiều hơn 99 mg/L so với hàm lượng NH4+ trong nước thải kỵ khí. Đặc biệt, hàm lượng NO2-, NO3- trong nước thải tuyển nổi gấp đôi trong nước thải kỵ khí. Vì hàm lượng NH4+, NO3-, NO2- trong nước thải tuyển nổi đều cao hơn trong nước thải kỵ khí, nên làm cho tổng đạm trong nước thải tuyển nổi là 481,90 mg/L, cao hơn gần 1,6 lần so với tổng đạm trong nước thải kỵ khí (298,00 mg/L). Hàm lượng PO43- trong nước thải tuyển nổi nhiều hơn 78,2 mg/L so với trong nước thải kỵ khí. Tổng lân trong nước thải tuyển nổi cũng nhiều hơn 73,9 mg/L so nước thải kỵ khí. Hàm lượng các chất dinh dưỡng (đạm, lân) trong nước thải sau khi xử lý tuyển nổi cao hơn so với nước thải sau khi xử lý kỵ khí. Quá trình xử lý kỵ khí đã loại bỏ đáng kể hàm lượng đạm, lân, nên nước thải kỵ khí chứa ít dinh dưỡng hơn.
COD (Chemical Oxygen Demand): Là lượng oxygen cần thiết để oxy hóa các hợp chất carbon hữu cơ đến CO2 và H2O bằng phương pháp hóa học. Hàm lượng đạm, và lân trong nước thải tuyển nổi cao hơn trong nước thải kỵ khí đã góp phần làm cho
Nước thải tuyển nổi
Nước thải
Chuyên ngành công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học19
COD trong nước thải tuyển nổi cao hơn trong nước thải kỵ khí. Theo số liệu đo được, COD trong nước thải tuyển nổi, trước khi được xử lý bằng vi tảo đạt 5307,00 mg/L, cao gấp 4,5 lần so với COD trong nước thải kỵ khí trước khi được xử lý bằng vi tảo (1169,00 mg/L).
Bảng 2. Tính chất của hai loại nước thải trước khi xử lý bằng vi tảo
Chlorella sp.
Chỉ tiêu Nước thải kỵ khí trước khi xử lý bằng Chlorella sp.
Nước thải tuyển nổi trước khi xử lý bằng Chlorella sp. NH4+ - N (mg/L) 328,90a 427,90 b NO3- - N (mg/L) 0,25 a 0,50 b NO2- - N (mg/L) 0,01 a 0,02 b Tổng đạm (mg/L) 298,00 a 481,90 b PO43- - P (mg/L) 87,20 a 165,50 b Tổng lân (mg/L) 270,30 a 344,20 b COD (mg/L) 1169,00 a 5307,00 b
Ghi chú: Các hàng có mẫu tự đi kèm giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,05) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.2 Đường tăng trưởng của vi tảo Chlorella sp. trong hai loại nước thải.
4.2.1 Đường tăng trưởng của vi tảo Chlorella sp. trong nước thải tuyển nổi. Vi tảo Chlorella sp. được chủng vào với mật số 1,36 x 106 tế bào/mL. Do Vi tảo Chlorella sp. được chủng vào với mật số 1,36 x 106 tế bào/mL. Do chuyển từ môi trường BBM sang môi trường nước thải, vi tảo cần thời gian thích nghi, nên mật số giảm mạnh xuống còn 0,72 x 106 tế bào/mL trong ngày thứ 2. Sau khi đã thích nghi với môi trường, mật số của vi tảo bắt đầu tăng trở lại vào ngày thứ 3, đạt 1,21 x 106 tế bào/mL. Vi tảo đạt đỉnh sinh trưởng 2,21 x 106 tế bào/mL ở ngày thứ 5, gấp 3 lần so với ngày thứ 2, và giảm nhẹ vào ngày thứ 6 xuống còn 2,16 x 106 tế bào/ml. Ở cuối chu kỳ quan sát, mật số vi tảo (2,16 x 106 tế bào/ml) đạt gấp 1,59 lần so với mật số vi tảo đầu vào (1,36 x 106 tế bào/ml). Vi tảo Chlorella sp. hấp thụ đạm lân trong nước thải thông qua quá trình quang hợp để chuyển thành sinh khối của tế bào. Do hàm lượng đạm, lân trong nước thải tuyển nổi ở mức cao (tổng đạm: 481,9 mg/L, tổng lân: 344,2 mg/L), tạo môi trường giàu dinh dưỡng cho vi tảo Chlorella sp. phát triển tốt (Bảng 7, phục lục).
Chuyên ngành công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học20
Hình 15. Đường tăng trưởng của vi tảo Chlorella sp. trong nước thải tuyển
nổi.
4.2.2 Đường tăng trưởng của vi tảo Chlorella sp. trong nước thải kỵ khí.
Vi tảo Chlorella sp. được chủng cùng mật số đầu vào 1,36 x 106 tế bào/mL. Do chuyển từ môi trường BBM sang môi trường nước thải, vi tảo cần thời gian thích nghi, nên trong 2 ngày đầu, mật số giảm liên tục. Ngày 2, mật số tảo giảm xuống thấp nhất chỉ còn 0,48 x 106 tế bào/mL. Sau thời gian thích nghi, vi tảo bắt đầu phục hồi và phát triển trở lại. Mật số vi tảo tăng trở lại từ ngày 3, đạt 0,67 x 106 tế bào/mL. Từ ngày 3 đến ngày 5, mật số vi tảo tăng đều, và đạt 1,15 x 106 tế bào/mL ở ngày thứ 5, sau đó giảm nhẹ vào ngày 6 còn 1,1 x 106 tế bào/mL. Ở cuối chu kỳ quan sát, mật số vi tảo gấp 2,29 lần so với ngày 2 (0,48 x 106 tế bào/mL), nhưng vẫn thấp hơn so với mật số vi tảo đầu vào (Bảng 8, phụ lục)
Chuyên ngành công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học21
Hình 16. Đường tăng trưởng của vi tảo Chlorella sp. trong nước thải sau
khi xử lý kỵ khí.
Vào cuối chu kỳ quan sát, mật số của vi tảo Chlorella sp. trong nước thải tuyển nổi đạt 2,16 x 106 tế bào/ml, gấp 1,96 lần so với mật số của vi tảo Chlorella sp. trong nước thải kỵ khí ở cùng ngày (1,1 x 106 tế bào/ml). Quá trình xử lý kỵ khí đã làm cho hàm lượng đạm, lân trong nước thải sau khi xử lý kỵ khí giảm đáng kể (tổng đạm: 298,0 mg/L, tổng lân: 270,3 mg/L), vì vậy vi tảo không phát triển mạnh như trong nước thải tuyển nổi.
Chỉ tiêu mật số vi tảo Chlorella sp. cho thấy vi tảo Chlorella sp. có khả năng phát triển trong cả hai loại nước thải, nhưng vi tảo Chlorella sp. phát triển trong nước thải tuyển nổi tốt hơn trong nước thải kỵ khí. Hàm lượng đạm, lân trong nước thải tuyển nổi cao, đã tạo thành môi trường giàu dinh dưỡng, giúp vi tảo phát triển tốt.
Chuyên ngành công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học22
4. 3 Khả năng xử lý đạm, lân của vi tảo Chlorella sp. trong nước thải tuyển nổi so với đối chứng. với đối chứng.
4.3.1 Khả năng xử lý đạm
Hình 17: Nước thải tuyển nổi có chủng vi tảo Chlorella sp so với đối chứng.
(Nguồn: Anh chụp 14/09/2013)
Sau 6 ngày xử lý, vi tảo Chlorella sp. đã loại bỏ 120,65 mg/L NH4+ trong nước thải tuyển nổi, tương đương 28,10%. Tổng đạm cũng đã giảm 149,94 mg/L, tương đương 31,11%. Tuy nhiên, hàm lượng NO3- tăng 0,84 mg/L, NO2- tăng 0,01 mg/L. Sau 6 ngày sục khí và chiếu sáng liên tục, trong mẫu đối chứng, hàm lượng NH4+ giảm 64,7mg/L, tương đương 14,97% , tổng đạm cũng giảm 105,05mg/L, tương đương 21,80%, hàm lượng NO3- tăng 2,45 mg/L, NO2- tăng 5,18 mg/L (Hình 18, bảng 3)
Nước thải tuyển nổi có chủng
vi tảo Chlorella sp.
Chuyên ngành công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học23 Ghi chú: Các cột có mẫu tự đi kèm giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P ≤ 0,05)
Hình 18. Khả năng xử lý đạm của vi tảo Chlorella sp. trong nước thải
tuyển nổi.
Bảng 3. Hàm lượng NO3-, NO2- trong nước thải tuyển nổi.
Chỉ tiêu Đầu vào Chlorella sp. Đối chứng
NO3--N (mg/L) 0,50 1,34 2,95 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
NO2--N (mg/L) 0,02 0,03 5,20
Vi tảo ưu tiên sử dụng NH4+ và các dạng khử khác của nitơ trong nước thải hơn là NO3- và NO2- (Matusiak, K. 1976). Theo McGriff, E.C. (1972), Chlorella sp. ưu tiên sử dụng NH4+ và các nguồn đạm hữu cơ có trong môi trường nuôi cấy hơn là các nguồn đạm vô cơ (NO3-, NO2-). Vì vậy, Chlorella sp. ưu tiên hấp thu NH4+ có trong nước thải, để chuyển thành sinh khối của tế bào thông qua quá trình quang hợp. Chính điều này làm cho hàm lượng NH4+ trong nước thải tuyển nổi giảm 28,10%. Bên cạnh, theo số liệu tính chất nước thải tuyển nổi trước khi xử lý (bảng 12 phụ lục), trong 3 nguồn đạm, thì hàm luợng NH4+ (427,90 mg/L) cao hơn hai loại còn lại NO3- (0,50mg/L), NO2- (0,20mg/L). Vì vậy, hàm lượng NH4+ giảm cũng là nguyên nhân góp phần làm cho tổng đạm giảm theo. Cũng theo McGriff, E.C. (1972), quá trình quang hợp của vi tảo trong điều kiện hiếu khí thúc đẩy các hợp chất của nitơ chuyển hóa thành NO3-. Theo Wang, L.M. (2010), quá trình phân hủy NO3- tạo ra NO2-. Chính hai
Chuyên ngành công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học24
điều này làm cho hàm lượng NO3- và NO2- trong nước thải tuyển nổi có chủng tảo tăng lên.
Trong mẫu đối chứng, hàm lượng NH4+, tổng đạm giảm ít hơn trong mẫu chủng tảo, nhưng hàm lượng NO3-, NO2- lại tăng mạnh hơn là do quá trình sục khí , làm cho các chất thải có ure bị phân hủy biến đổi thành ammoniac. Sau đó, các ammoniac này được biến đổi thành dạng nitrite (NO2-) và nitrate (NO3-) (Trần Văn Nhân et al., 1990).
4.3.2 Khả năng xử lý lân
Trong mẫu chủng tảo, 74,94% PO43- , 89,74% tổng lân bị loại bỏ sau 6 ngày theo dõi. Vi tảo Chlorella sp. đã sử dụng đạm, và lân trong nước thải để tổng hợp thành sinh khối thông qua quá trình quang hợp. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Tam, N.F.Y. (1988), quá trình quang hợp của vi tảo Chlorella sp. đã giúp loại bỏ hơn 2/3 hàm lượng lân có trong nước thải. Điều này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Lodi, A. (2003) là Chlorella sp. có khả năng khử phosphate.
Hình 19. Phần trăm PO4 và Tổng lân trong nước thải tuyển nổi bị được vi
tảo Chlorella sp. loại bỏ so với đối chứng.
Trong mẫu đối chứng, 55,02 % PO43-, 80,83% tổng lân bị loại bỏ sau 6 ngày theo dõi, thấp hơn trong mẫu chủng tảo. Mẫu đối chứng tuy không được chủng tảo,
Chuyên ngành công nghệ sinh học Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học25
nhưng vẫn được chiếu sáng và sục khí liên tục. Quá trình sục khí liên tục, tương tự như xử lý hiếu khí, đã làm lân bị phân hủy.
4.3.3 Khả năng xử lý COD
So với mẫu đối chứng, mẫu có chủng tảo Chlorella sp. đã loại bỏ được 70,38% COD. Trong khi, mẫu đối chứng chỉ loại bỏ được 37,05% COD. Quá trình quang hợp của vi tảo trong điều kiện hiếu khí, giúp loại bỏ các chất vô cơ và hữu cơ, nên làm cho COD trong mẫu có chủng tảo Chlorella sp. giảm 70,38%. Điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của Eny, D.M. (1951), vi tảo có thể sử dụng các nguồn carbon hữu cơ có