100 vòng/phút, 24 giờ) với các nồng độ alginat khác nhau
2.3.2. Phương pháp cố định tế bào trong hạt Calci alginat
Pha các dung dịch sau :
300ml dung dịch 2% vào bình nón 500ml 400ml dung dịch NaCl 0,9% vào bình nón 500ml
50ml dung dịch Natri alginat 2%, 4% vào bình nón 250ml
Đem hấp tiệt trùng ở điều kiện 1atm/20 phút, sau đó lấy ra để nguội. Với các bình alginat có nồng độ 2%, 4%, ta thêm sinh khối ướt đã chuẩn bị ở 2.3.1.b vào, lắc đều, đem khuấy từ với tốc độ 500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 phút để tạo hỗn dịch đồng nhất, sau đó để yên 5 phút để loại bọt khí.
Dùng pipet Pasteur nhỏ hỗn dịch này vào cốc đựng 50 ml dung dịch 2% đã tiệt trùng, hạt sẽ tạo thành, để yên 30 phút cho hạt ổn định rồi rửa hạt 3 lần bằng dung dịch NaCl 0,9% đã tiệt trùng.
Ngay sau khi thu được hạt, cho 10gam hạt vào mỗi bình 100ml NaCl 0,9% đã được tiệt trùng và tiến hành nuôi cấy ở máy lắc với tốc độ khác nhau (100
vòng/phút hoặc 150 vòng/phút tùy vào từng thí nghiệm). Sau 24 giờ ta tiến hành thu lấy dịch nuôi cấy và hạt.
Ly tâm phần dịch sau khi loại hạt để thu lấy sinh khối ướt, phần hạt được phá bằng dung dịch Natri citrat để xác định lượng sinh khối trong hạt.
Hình 2.1: Phương pháp tạo hạt gel Calci alginat
Trong quá trình cố định tế bào thì ta cần lưu ý :
Khi khuấy phải khuấy đủ thời gian để tạo hỗn hợp đồng nhất, khuấy xong phải để khoảng 5 phút để bọt khí thoát hết ra ngoài rồi mới đem tạo hạt.
Sau khi tạo hạt xong phải để yên khoảng 30 phút để ion có thể thấm vào bên trong hạt để đảm bảo độ chắc của hạt. Nếu để lâu hơn 30 phút thì vi khuẩn
B. subtilis natto có thể thiếu dinh dưỡng và bị chết, dẫn tới sai số. Sau khi vớt hạt phải rửa sạch ion và tế bào bám bên ngoài hạt để tránh sai số cho các thực nghiệm tiếp theo [3].
Lúc đầu các hạt nổi trên mặt nước do ion chưa thấm vào trong hạt nên khi tạo hạt phải chú ý nhỏ giọt vào phần mà không có hạt để tránh các hạt dính vào với nhau.