cây thân gỗ trên thế giới
Vi nhân giống của các loài cây thân gỗ lưu niên là một công việc vô cùng khó khăn do nhiều nguyên nhân khác nhau như nhiễm trùng ngoại sinh và nội sinh, sự hiện diện của hợp chất phenolic, chu kỳ sống kéo dài phức tạp, các biến thể di truyền lớn, vv…(Bajaj, 1997, Zimmerman, 1985). George (1993) cho rằng trong nhân giống in vitro của các loài thực vật thường bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như kiểu gen, tuổi và nguồn mô thực vật ban đầu.
Trong thập niên 90, cây thân gỗ ( cây ăn trái và cây rừng) được đặc biệt chú ý nhằm mục tiêu ứng dụng những kỹ thuật hiện đại của công nghệ sinh học thực vật vào cải thiện và nhân nhanh các loài cây thân gỗ và cây trồng rừng có giá trị kinh tế như: cây ăn quả, cây có múi, cà phê…Việc nuôi cấy mô các loài cà phê trên thế giới đã đạt được những tiến bộđáng kể. Quá trình phát sinh phôi vô tính cây cà phê vối Coffea canephora được Staritsky báo cáo lần đầu tiên vào năm 1970; Sondahl và Sharp, 1977 cũng tạo được cây cà phê chè Coffea arabica
từ phôi vô tính. Tiếp theo đó nhằm mục đích nhân giống cà phê, nhiều tác giảđã nghiên cứu sự phát sinh phôi vô tính cây cà phê như Staristky G. (1970); Pierson
et al. (1993); Hatanaka et al. (1991);... Các công trình nghiên cứu này cho thấy có 3 tiến trình chính trong nhân nhanh cây cà phê bằng phương pháp phát sinh phôi vô tính, đó là: Nhân tế bào có tiềm năng phát sinh phôi và sản xuất phôi (giai đoạn thủy lôi) trong môi trường lỏng; giúp phôi nảy mầm bằng cách làm ngập tạm thời phôi (giai đoạn có lá mầm) trong môi trường lỏng; tạo điều kiện cho phôi nảy mầm phát triển thành cây con.
Nuôi cấy phát sinh và tái sinh phôi vô tính ở cây cà phê phụ thuộc vào nhiều điều kiện như: tình trạng sinh lý của lá đưa vào nuôi cấy, loại mô lá, kích thước mẫu nuôi cấy nhỏ hay lớn, đã nuôi cấy đỉnh chồi vượt, thời gian cấy chuyển, điều kiện khí hậu, kiểu gen. Sự biệt hóa tế bào phôi vô tính cà phê được
điều khiển bởi môi trường vật lý hay các chất kích thích sinh trưởng và sự cân bằng auxin/cytokinin trong nuôi cấy, dinh dưỡng khoáng. Phôi vô tính cà phê
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19
sẹo màu vàng chanh có hiệu suất phát sinh phôi vô tính cao. Kỹ thuật nuôi cấy phôi và tái sinh phôi vô tính ngày càng hoàn chỉnh. Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa, nghiên cứu tạo phôi vô tính là rào cản đầu tiên trong công nghệ phôi vô tính cây cà phê.
Năm 1973, Afocel đã khởi sự nghiên cứu nhân giống vô tính cây bạch đàn nhằm mục đích sản xuất lớn các dòng vô tính chịu lạnh, năng suất gỗ cao. Người ta đã tạo cây từ hạt nảy mầm trong ống nghiệm, hoặc cắt các chồi non từ các cây chọn lọc, từ cành ghép. Từ 1975, cây cấy mô được bắt đầu trồng ra ngoài đất với số lượng 20000 cây/tháng.
Tại hội nghị Kaset Sart, Thái Lan năm 1994 cũng đã báo cáo kết quả nhân giống thành công 55 loài tre trúc và phục vụ dự án trồng rừng Thái Lan, với sản lượng 1 triệu cây con/năm (Pranon Prutgongse,1994).
Ở Malaysia cũng đã có kết quả vi nhân giống loài gỗ như Acacia mangium, Gmelia arborea (Marziah Mahmood, 1995).
Trong nhân giống cây Hông (Paulownia fortunei): Radojevic L. (1979) từ
mô hữu tính tạo mô sẹo và nuôi cấy mô sẹo sau đó tạo phôi trực tiếp từ mô sẹo và cho phôi phát triển trên môi trường MS. Marcotrigiano et al.(1983);Burger D.W (1985) nuôi cấy chồi nách tạo ra cây trên môi trường MS/2. Viện Sinh học nhiệt đới đã nhập giống gốc, nhân bằng phương pháp nhân cụm chồi trên môi trường MS.
Cây Giổi xanh (Michelia mediocris) chủ yếu trồng từ hạt. Chưa có nghiên cứu nào về nhân giống vô tính- kể cả bằng phương pháp nuôi cây mô và giâm hom, ghép chồi. Trong nhiều năm qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật liên quan đến tái sinh cây con từ mô phân sinh đã được phát triển và bàn luận như các chủ đề quan tâm đặc biệt. Tuy nhiên, trong thời gian gần đây phương pháp này đã đạt được trên cơ sở khai thác thành công quy mô thương mại của kỹ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20
1.3.2 Tình hình nghiên cứu về nhân giống trong nuôi cấy in vitro của một số
cây thân gỗở Việt Nam
Hiện nay, Việt Nam đã nuôi cấy thành công một số loại cây thân gỗ gồm: cây ăn trái như cam, quýt, nhãn..và một số cây rừng như bạch đàn, keo, dó bầu, cẩm lai…Ngành nuôi cấy mô Việt Nam đã thoát khỏi giai đoạn phôi thai của nó và đang phát triển mạnh mẽ phục vụ cho nền sản xuất nông nghiệp hiện đại. Cho
đến nay, kỹ thuật nuôi cấy mô trên đối tượng cây thân gỗ ở mức độ nghiên cứu chưa đi sâu vào phục vụ cho sản xuất thương mại. Tuy nhiên cũng có những thành công phục vụ cho công tác cải thiện giống cây ăn trái và phục hồi rừng( Trần Văn Minh, 2004).
Những thuận lợi và khó khăn trong nuôi cấy in vitro cây thân gỗ: Có rất nhiều những điểm khác nhau giữa kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro cây thân thảo và cây thân gỗ đăđúc kết:
Các loại cây thân gỗ ít có khả năng tái sinh hơn cây thân thảo.
Các nghiên cứu nhân giống trên cây thân gỗ được bắt đầu muộn hơn so với cây thân thảo.
Việc trẻ hoá cây thân gỗ khó hơn cây thân thảo. Tốc độ nhân giống cây thân gỗ thấp hơn.
Cây thân gỗ dễ bịảnh hưởng bởi các chất độc tiết ra trong môi trường nuôi cấy.
Mô cây thân gỗ khó khử trùng hơn do đa sô sống trong tự nhiên.
Cây thân gỗ thường được chọn nhân dòng sau khi trưởng thành vì thế
mô rất khó hoặc không thể sử dụng trong nuôi cấy in vitro.
Sựđa dạng về mặt di truyền cây thân gỗ lớn hơn các loại cây thân thảo do đó sau khi nhân giống thu được nhiều kết quả khó kiểm soát.
Cây thân gỗ rất khó trồng trong nhà kính vì vậy việc thu mẫu thường bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài tự nhiên.
Tuy nhiên kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro trên cây thân gỗ vẫn có một số
những thuận lợi ( Trần Văn Minh, 2004) như sau:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21
Sau khi trẻ hoá nuôi cấy in vitrotốc độ tăng sinh in vitro càng lúc càng nhanh hơn tăng sinh in vivo.
Sinh trưởng và phát triển cây invitro nhanh hơn cây mọc từ hạt.
Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng kết hợp xử lý nhiệt giúp làm sạch bệnh và trẻ hoá cây thân gỗ.
Cây invitro được nhân nhanh quanh năm trong phòng thí nghiệm. Sau khi được tiến hành trẻ hoá in vitro, cây thân gỗ invitro sẽđược sử
dụng làm cây mẹđầu dòng cho quá trình nhân nhanh invivotrong vườn ươm. Dễ dàng tạo biến tính tế bào soma in vitro phục vụ công tác chọn dòng
đột biến.
Sử dụng phướng pháp sinh trưởng chậm để phục vụ cho công tác bảo tồn, lưu giữ nguồn gen đang bị thoái hoá hoặc tiêu diệt.
Ở nước ta, cây Trai Nam Bộ là loại cây gỗ quý, gỗ thuộc nhóm I. Đây là cây gỗ quý hiếm được xếp vào các loại cây đang bịđe dọa và mức độđe dọa theo phân hạng của Tổ chức bảo tồn thiên nhiên thế giới (UICN, 2001) là rất nguy cấp và phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên rất cao trong một tương lai rất gần. Từ kết quả thực nghiệm, đạt được một số kết quả sau: Mẫu Trai thực sinh được vô trùng tốt nhất trong dung dịch NaOCl 25% với thời gian 20 – 30 phút kết hợp với dung dịch HgCl2 0,05% trong 15 phút. Môi trường WPM + BAP (0,1 mg/l) thích hợp nuôi cấy phát sinh chồi cây Trai in vitro. Môi trường WPM + BAP (1 mg/l) thích hợp cho nuôi cấy tạo cụm chồi cây Trai. Môi trường WPM bổ sung BAP (0,5 mg/l) thích hợp cho nhân cụm chồi cây Trai. Môi trường WPM thích hợp cho quá trình tái sinh cụm chồi cây Trai in vitro. Môi trường WPM + BAP (0,1 mg/l) + CW (10 %) thích hợp cho quá trình vươn thân cây Trai in vitro. Cây Trai in vitro ra rễ dễ dàng trong môi trường WPM + IBA (0,3 mg/l) ( Khưu Hoàng Minh, 2006).
Cây bao báp (Adansonia grandidieri L.) là loại cây thân đại mộc, hiếm ở
Việt Nam. Do đó, vấn đề bảo tồn loài cây này rất cần thiết. Môi trường tốt nhất cho sự nảy mầm của hạt là môi trường cơ bản MS bổ sung 1,0 mg/L BA + 0,1 mg/l α-NAA. Môi trường tốt nhất cho sự tạo chồi từđỉnh chồi và đoạn thân mang
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
chồi nách của cây bao báp in vitro là môi trường cơ bản MS bổ sung 4,0 mg/l kinetin + 0,1 mg/l α-NAA. Chồi được tạo rễ trên môi trường cơ bản MS có bổ
sung IBA hoặc α-NAA, hình thành rễ tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/l α-NAA. Cây nảy mầm in vitro và cây in vitrođược đưa ra giá thểđất và cát với tỷ lệ 1:1, thích nghi với điều kiện tự nhiên và cho tỷ lệ sống sót đạt 93,33 %.
Sự nuôi cấy Aquilari crassna. Pierre được thực hiện từ chồi ngọn và chồi nách của cây in vitro. Sự nhân chồi được thực hiện từ chồi ngọn trên môi trường MS chứa BAP 0,2 mg/l; kinetin 0,2 mg/l và adenin 0,1 mg/l. Sự tăng trưởng của ngọn chồi (chứa mô phân sinh ngọn hay chồi nách) xảy ra trên môi trường MS không hormon, từ các đoạn cắt chứa 1 - 2 đốt (chồi nách ở trạng thái ngủ). Trên môi trường 1/2 MS, sau 15 ngày nuôi cấy, sự tái sinh của các mẫu cấy có sự khác biệt cả về tỷ lệ tái sinh và phẩm chất của chồi tái sinh. Các đoạn thân của chồi nách có khả năng tái sinh mạnh, tốc độ tái sinh cao, phẩm chất cây tốt.
Theo nghiên cứu thử nghiệm nhân giống một số cây trồng rừng bằng phương pháp nuôi cấy mô (Bạch đàn E.Urophyla, Hông, Trầm hương, Giổi xanh) đã thu được kết quả sau:
Cây Hông:
- Chất khử trùng phù hợp cho cây Hông là calcium hypochlorite nồng độ
10%, thời gian khử trùng là 25 phút
- Môi trường phù hợp nhất cho sự tạo cụm chồi là môi trường Hc7 (BAP 7mg/l). Môi trường phù hợp nhất cho sự phát triển chồi là môi trường Hc1 (BAP: 1mg/l, chiều cao chồi 4,89cm)
- Môi trường Hr2 (α-NAA: 0,2mg/l) là môi trường phù hợp nhất cho sự ra rễ cây Hông
Cây Trầm hương:
- Khử trùng mẫu cấy cho tỷ lệ sống cao nhất là chất HgCl2 nồng độ 0,1%, thời gian khử là 7 phút
- Môi trường tốt nhất cho sự tạo chồi, cụm chồi và phát triển chồi là môi trường Tc1(nồng độ BAP: 0,1 mg/l).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
Cây Giổi xanh:
- Chất khử trùng phù hợp là calcium hypochlorite với nồng độ 10% trong thời gian 20 phút
- Môi trường tốt nhất cho nuôi cấy là MS có bổ sung VitaminC nồng độ 10mg/l - Môi trường tốt nhất cho sự tạo chồi, cụm chồi và phát triển chồi cụm chồi là Gc4 (nồng độ BAP: 0,5mg/l). Môi trường tốt nhất cho sự phát triển chồi là môi trường Gc1 (nồng độ BAP là 0,1mg/l)
- Môi trường tốt nhất cho sự tạo rễ là Gr3 (có α-NAA: 1mg/l)
Cây Bạch đàn:
- Khử trùng mẫu cấy: calcium hypochlorite (10%) trong 15 phút và lần 2 với HgCl2 0,1% trong 7 phút cho tỷ lệ mẫu sống không bị nhiễm cao nhất
- Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo và phát triển cụm chồi là môi trường MS có bổ sung BAP 0,5mg/l và kinetin 0,3 mg/l
- Sự phát triển chồi: Môi trường tốt nhất cho phát triển chồi là môi trường có BAP 0,3mg/l; α-NAA 0,3mg/l
- Sự tạo rễ: Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo rễ bạch đàn là môi trường IBA 0,5mg/l và α-NAA 0,5mg/l
Nguyễn Thị Quỳnh & cs (2006) đã tiến hành: “Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên sự tăng trưởng của một số cây thân gỗ nhiệt đới và cận nhiệt đới trong điều kiện nuôi cấy in vitro”, đã rút ra kết luận: Các cây in vitro
phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy không có đường và vitamin và độ thoáng khí của bình nuôi cấy cao. Tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn giảm đáng kể (2-0%), ngược với phương pháp nuôi cấy truyền thống trên môi trường có đường và vitamin tỷ
lệ nhiễm lên tới 10% trên tổng số cây nuôi cấy ban đầu. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của khí khổng ở mặt dưới lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây nuôi theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở
trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ
lệ cây sống 95-100% sau 1 tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không đường, trái lại chỉ từ 70-80% theo phương pháp truyền thống. Việc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
kiểm soát các điều kiện vật lý của môi trường nuôi cấy giúp cho cây in vitro gia tăng sử dụng CO2 trong không khí, thay vì phụ thuộc vào nguồn carbon duy nhất là đường và các chất hữu cơ khác như vitamin trong môi trường nuôi cấy, vì vậy cây in vitro trong điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng có khả năng phát triển gần giống như cây ngoài tự nhiên. Việc giảm nồng độ hay loại bỏ hẳn đường và các vitamin sẽ góp phần giảm ô nhiễm cho môi trường xung quanh do tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn trong quá trình nuôi cấy giảm. Đồng thời sử dụng phương pháp nuôi cấy mới này còn góp phần làm giảm lượng CO2 trong không khí nhờ sự gia tăng hoạt động của cơ quan quang hợp của cây in vitro trong quá trình nuôi cấy.
Nghiên cứu, tìm hiểu ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên quá trình phát sinh hình thái của mô lá cây hoắc hương (Pogostemon cablin (Blaco) Benth) nuôi cấy in vitro cho thấy các chất điều hòa sinh trưởng của nhóm auxin (α-NAA, IBA, 2,4-D) và nhóm cytokinin (BAP, kinetin) đã được bổ sung riêng rẽ hoặc kết hợp vào môi trường MS ở các nồng độ khác nhau. Tất cả các công thức thí nghiệm đều kích thích sự hình thành mô sẹo từ các mảnh lá nuôi cấy. Tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất khi bổ sung phối hợp α-NAA với BAP. Chồi cũng hình thành ở các công thức sử dụng môi trường MS bổ sung α-NAA, IBA và kinetin riêng rẽ. Chồi không hình thành ở các công thức bổ sung 2,4-D. Nhiều thể chồi hình thành ở môi trường bổ
sung 0,5 và 0,7 mg/l BAP. Ở các nồng độ bổ sung BAP khác, chồi không hình thành. Ngoài ra, ở các công thức phối hợp α-NAA (0,5 mg/l) và BAP tỷ lệ hình thành chồi rất thấp và giảm đi khi hàm lượng BAP tăng lên và ở nồng độ 1 mg/l BAP chồi không được hình thành (Tạ Thục Anh và cs, 2007).
Tại đại học Cần Thơ, cây muồng hoa pháo (Calliandra calothyrsus) in vitro được nghiên cứu bao gồm 3 thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên. Kết quả cho thấy: môi trường thích hợp cho tạo chồi là MS bổ
sung 0,5-1 mg/l BAP (2,5-2,9 chồi/mẫu cấy), môi trường 1/2 MS bổ sung 2mg/l NAA cho rễ hình thành nhiều và phát triển bình thường ở giai đoạn tạo rễ, sử
dụng giá thể cát để tiến hành thuần dưỡng cây cấy mô ở vườn ươm cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 80%. (Mai Vũ Duy và cs, 2014).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
Qua trên, chúng ta có thể thấy các kết quả nghiên cứu còn hạn hẹp, đặc biệt với đối tượng cây rau Báng thì có rất ít các nghiên cứu chuyên sâu. Trong giai đoạn hiện nay để có thể trồng cũng như thương mại hoá cây trồng này thì