Xfg là trị s ố trung bình tín hiệu đo của mẫu trắng.
ơ là sai lệch chuẩn có trị sốXỵg.
Thông thường giói hạn định lượng được chấp nhận là 3x. Một số tác giả chắc chắn hơn đã chọn trị số 5x thậm chí đến lOx. Ngoài ra còn có phương pháp xác định trực tiếp giới hạn định lượng bằng cách giảm nồng độ hoạt chất định lượng trong mẫu cho đến khi sai số tương đối không vượt quá 15%. Có
thể chuyển tín hiệu X sang nồng độ (C) thông qua phương trình đưòfng chuẩn
X = f (C).
Trong trường hợp của chúng tôi, tín hiệu mẫu trắng (diện tích AUC) bằng không, vì vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp ngoại suy xác định tín hiệu XxB thông qua các dung dịch GF có nồng độ xác định.
I
Sự phụ thuộc giữa diện tích pic - nồng độ là một phương trình bậc nhất có hệ số tương quan » 1. Phương trình đường hồi quy tuyến tính được xây dựng trong ngày phân tích.
e/ Độ ổn định của GF trong mẫu thử.
Mẫu huyết tương tại thời điểm bất kỳ được bảo quản ở t° = - 40°. Sau những khoảng thời gian khác nhau tiến hành chạy sắc ký và tính nồng độ GF để đánh giá độ ổn định của mẫu trong thời gian bảo quản.
4.2. B ố trí thí nghiêm và lấy mẫu
Tiếm bắp cho chó với liều 0,6mg.
Lấy mẫu điểm 0 (trắng) trước khi tiêm thuốc để so sánh, kiểm tra tính chọn lọc và kiểm định phương pháp.
Vì GF chưa có tài liệu nào nghiên cứu và công bố về Dược động học nên chúng tôi phải tiến hành bước đầu khảo sát sự biến thiên nồng độ GF trong huyết tương bằng cách lấy mẫu máu tại các thời điểm 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,
16, 18, 20, 24 giờ.
Sau khi đã sơ bộ đánh giá được khoảng thời gian thuốc đạt nồng độ tối đa trong máu chúng tôi tiến hành lấy mẫu máu từ tĩnh mạch đùi chó bằng phương pháp bộc lộ tĩnh mạch trực tiếp tại các thời điểm 0 giờ, ít nhất 4 điểm ở pha hấp thu, 3 điểm xung quanh thời điểm 4 đến 6 điểm ở pha thải trừ.
Mẫu máu được xử lý.
Định lưọíng nồng độ GF trong huyết tương chó bằng phương pháp HPLC- MS với điều kiện phù hợp mà chúng tôi đã khảo sát.
4.3. Xây dựng đường cong Dược động học. di! Phương pháp chiết GF trong huyết tương chó:
b/Chọn điều kiện chạy HPLC-MS
*Cột sắc ký: Khảo sát khả năng tách và định lượng GF trong huyết tương trên các cột sắc ký Cg, Cj8 và Cột Hypersil BDS Cyano (5 I^m,
150*4,6mm) để tìm cột phù hợp có khả năng tách GF ra khỏi mẫu phân tích. *Pha động: Tiến hành khảo sát khả năng định lượng GF trong huyết tương bởi những hệ pha động khác nhau để tĩm ra một pha động có khả năng tách tốt và có thời gian phân tích hợp lý dùng trong phân tích mẫu:
MeOH - H2O (8/2; 7/3; 6/4; 5/5) - Focmic Acid 0,2% (v/v) Acetonitril - ỈỈ2 0 (8/2 ; 7/3; 6/4; 5/5) - Focmic acid 0,2% (v/v)
*Lưu lượng dòng: Thay đổi lưu lượng dòng từ 0,7 - 1.2 ml/phút để tìm lưu lượng dòng phù hợp có thể tách riêng pic của GF và các píc khác.
*Thể tích mẫu tiêm: lOịal (C = Ippm) * Chọn điều kiện làm việc cho detector MS
Từ mẫu chuẩn GF tinh khiết ta pha thành dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1 |ag/ml và bơm trực tiếp vào Detector.
+ Chế độ chạy MS Fullscan - ESI + (150 - 650).
+ Đặt nhiệt độ ống phun mao quản bằng (ES probe Temp) 550° c. + Đặt điện thế ion hóa; 2 kV (Needle Voltate).
+ Điện thế chóp nón (Cone Voltage) lần lượt 30V, 40V, 50V, 60V, 70V, 80V, 90V, lOOV.
Sử dụng độ sắc nét của pic, diện tích pic và thời gian lưu để đánh giá kết quả. Căn cứ vào một loạt kết quả thu được chúng tôi sẽ quyết định lựa chọn điều kiện sắc ký cho phù hợp.
Chuẩn bị các mẫu dung dịch GF trong huyết tương có nồng độ như sau: 10; 20; 40; 80; 100; 120; 150; 170; 200 ppb. Xử lý mẫu và tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC - MS . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Yêu cầu:
- Trên sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng không có pic tại vị trí pic của GF trên sắc ký đồ của mẫu có thêm GF chuẩn.
- Phải có sự tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của GF trong khoảng khảo sát.
- Các pic thu được phải gọn, cân đối, không lẫn với pic tạp và có thời gian lưu hợp lý.
d/ Xác định hiệu suất chiết GF trong huyết tương.
Mẫu thử: Cho một lượng chính xác GF vào trong một thể tích chính xác huyết tương chó, cụ thể là cho 0,1 |j,g GF chuẩn vào 01 ml huyết tưoỉng sau đó chiết bằng 02 ml Chloroform, lấy chính xác 01 ml dịch chiết Chloroform bay hơi hết dung môi sau đó hòa cắn vào 0,5 ml Methanol, ta được mẫu thử chạy HPLC - MS.
Mẫu chuẩn: Pha GF chuẩn trong pha động cùng nồng độ như mẫu thử được dung dịch chạy HPLC - MS.
e/ Định lượng GF trong huyết tương.
Tiến hành xử lý và chạy sắc ký các mẫu huyết tương tại những thời điểm khác nhau. Định lượng theo phương pháp đường chuẩn, tính kết quả dựa vào đường chuẩn xây dựng trong ngày phân tích. Tại điểm đầu và điểm cuối của chương trình lấy mẫu, nếu nồng độ GF thấp có thể tính kết quả theo phương pháp so sánh.
4.4. Phương pháp xử lý số liệu.
Các số liệu được xử lý nhờ chương trình Excel 2003.
Tính toán và xử lý các thông số Dược động học có sự trợ giúp của phần mềm winnolin.
Các đại lượng thống kê được tính như sau: [2] - Giá trị trung bình:
n
i = 1
JC = i
n - Đô lêch chuẩn:
SD =
- Độ lệch chuẩn tương đối: RSD% = — 100
X