Khi đã đem về phòng thí nghiệm ta cấy mẫu swab lên bề mặt đĩa thạch môi trường MC có chứa ceftaxidime 2mg/l. Đem ủ ở 370
C trong 24 giờ.
Tiếp theo, ta chọn 10 khuẩn lạc điển hình nghi là E. coli (tr n, hơi lồi, bóng, màu thẫm tím, có ánh kim) tiếp tục cấy thuần trên môi trường NA. Sau 24 giờ thử sinh hóa IMViC để khẳng định vi khuẩn E. coli.
Phản ứng sinh indol
Cấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton có bổ sung tryptophan, ủ ở 370C. Sau 24 giờ, nhỏ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường và lắc nhẹ.
Phản ứng dương tính: trên bề mặt có v ng màu đỏ. Phản ứng âm tính: không chuyển màu.
Phản ứng MR
Cấy vi khuẩn vào môi trường nước VP-MR, nuôi ở 370C. Sau 24 giờ, nhỏ vào 5 giọt dung dịch thuốc thử và đọc kết quả.
Loại gà Số mẫu
Gà 1 tuần tuổi 6
Gà 1 tháng tuổi 6
Gà đẻ 12
17
Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu đỏ. Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng.
Phản ứng VP
Cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường VP-MR, nuôi cấy ở 370C. Sau 48 giờ, nhỏ vào môi trường nuôi cấy trên 0,6 ml dung dịch 1 và 0,2 ml dung dịch 2. Đọc kết quả sau 15 phút và 1 giờ.
- Phản ứng dương tính: môi trường có màu đỏ hồng đậm.
- Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng hoặc không biến màu.
Sử dụng citrat
Cấy vi khuẩn vào thạch simon citrat nuôi ở 370C từ 18 giờ đến 24 giờ. Vi khuẩn sử dụng citrat (dương tính) làm môi trường chuyển sang màu xanh nước biển, âm tính khi môi trường giữ nguyên màu xanh lá cây.
Tiến hành thực hiện phương pháp đĩa kết hợp trên môi trường MHA để xác định vi khuẩn E. coli ESBL, các bước thực hiện như sau:
Chuẩn bị ống nghiệm có chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng và đĩa petri có thạch MHA. Cấy vi khuẩn từ đĩa NA cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý, lắc đều và so độ đục với độ đục chuẩn Mac Farland 0.5 có chứa 108CFU/ml.
Dùng tampon vô trùng nhúng vào huyễn dịch vi khuẩn, ép vào thành ống cho bớt dịch rồi phết đều lên trên mặt thạch MHA. Chờ sau khi mặt thạch khô tiến hành đặt 4 đĩa kháng sinh lên trên bề mặt đĩa sao cho khoảng cách giữa 2 đĩa kháng sinh từ 23-25 mm. Đĩa 1 chứa ceftaxidime 30 ( g), đĩa 2 chứa ceftaxidime + acid clavulanic (30µg/10µg), đĩa 3 chứa ceftotaxime (30 g) và đĩa 4 chứa ceftotaxime+ acid clavulanic (30µg/10µg).
Đem đĩa ủ ở nhiệt độ 370
C trong 24 giờ. Đo v ng vô khuẩn của 4 đĩa kháng sinh, nếu đường kính của đĩa 2 trừ đường kính đĩa 1 và đĩa 4 trừ đĩa 3 lớn hơn hoặc bằng 5 mm thì khẳng định đây là E. coli ESBL.
18 Mẫu Swab
Mac conkey agar (MC) có bổ sung kháng sinh cefatazidime (2mg/l)
Cấy thuần 10 khuẩn lạc qua môi trường Nutrient agar (NA)
Thử sinh hóa IMViC (++--) hoặc AIPIE20
Khẳng định E. coli
Phƣơng pháp đĩa kết hợp
Đo đường kính vòng vô khuẩn nếu có sự khác biệt giữa đĩa 1 và 2, đĩa 3 và 4 > 5mm
E. coli ESBL
Hình 3.3 Quy trình phân lập E. coli ESBL 370C 24 giờ
370C 18-24 giờ 1
Đĩa 1: cefatazidime (30μg)
2
Đĩa 2: cefatazidime +acid clavulanic (30μg/10μg)
4
Đĩa 4: cefotaxime + acid clavulanic (30μg)
3
19
Hình 3.2 Phản ứng IMViC định danh vi khuẩn E. coli
Ghi chú:
ống nghiêm 1: thử nghiệm citrate âm tính ống nghiệm 2: thử nghiệm VP âm tính ống nghiệm 3: thử nghiệm MR dương tính ống nghiệm 4: thử nghiệm indol dương tính