3.1.1 Thời gian, địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu Thời gian: từ tháng 08/2014 đến tháng 12/2014.
Địa điểm nghiên cứu: một số trại gà công nghiệp huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng
Địa điểm xét nghiệm mẫu: phòng thí nghiệm vi trùng và miễn dịch, Bộ môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.
Đối tƣợng nghiên cứu: nghiên cứu trên mẫu phân gà thịt khỏe (giai đoạn 1 tuần, 1 tháng tuổi) và gà đẻ khỏe.
3.1.2 Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ và thiết bị
Ống đong các loại: 25ml, 50ml, 100ml, 250ml, 500ml.
Bình tam giác, bình nhựa đựng nước, cốc thủy tinh, bình định mức. Micropipet, Pipet các loại: 1ml, 2ml.
Kéo, pen, kẹp, đèn cồn, tampon vô trùng, túi nilong, găng tay, thùng trữ lạnh, ống nghiệm, đĩa petri, giá đựng ống nghiệm, que cấy.
Cân điện tử, tủ sấy vô trùng, tủ ấm, tủ lạnh, autoclauve, bếp đun cách thủy, buồng cấy vô trùng.
Môi trƣờng, hóa chất và kháng sinh
Glycerol, cồn 700, cồn 900, nước cất, thuốc thử Methyl Red, Kovacs, VP1, VP2 và một số hóa chất khác.
Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật: MacCONKEY agar (MC), Nutrient Agar (NA), Muller Hinton agar (MHA), Eosin methylene blue (EMB), Nutrient broth (NB), Trypton Wasser, MR-VP broth, SIMMONS citrate agar, Sodium chlorid.
Các loại kháng sinh sử dụng: ampicillin 10μg, cefuroxime 30μg, cefaclor 30μg, gentamycin 10μg, streptomycin 10μg, kanamycin 30μg, amikacin 30μg, tetracycline 30μg, doxycycline 30μg, norfloxacin 10μg, fosfomycin 50μg, trimethoprim 5μg, ofloxacin 5μg.
16
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu 3.2.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu
Tổng số gà khảo sát là 24 mẫu phân (6 gà 1 tuần tuổi, 6 gà 1 tháng tuổi và 12 gà đẻ). Lấy mẫu phân bằng cách dùng tampon vô trùng xoay lỗ huyệt, sau đó bỏ vào cary blair để trữ lạnh trong thùng xốp có đá khô (không để mẫu tiếp xúc trực tiếp với các khối đá khô và được bảo quản tối đa 24 giờ).Ghi kí hiệu và vận chuyển đến phòng thí nghiệm và xử lý.
Bảng 3.1 Dung lượng mẫu cần lấy
3.2.2 Phân lập E. coli ESBL
Khi đã đem về phòng thí nghiệm ta cấy mẫu swab lên bề mặt đĩa thạch môi trường MC có chứa ceftaxidime 2mg/l. Đem ủ ở 370
C trong 24 giờ.
Tiếp theo, ta chọn 10 khuẩn lạc điển hình nghi là E. coli (tr n, hơi lồi, bóng, màu thẫm tím, có ánh kim) tiếp tục cấy thuần trên môi trường NA. Sau 24 giờ thử sinh hóa IMViC để khẳng định vi khuẩn E. coli.
Phản ứng sinh indol
Cấy vi khuẩn vào môi trường nước pepton có bổ sung tryptophan, ủ ở 370C. Sau 24 giờ, nhỏ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường và lắc nhẹ.
Phản ứng dương tính: trên bề mặt có v ng màu đỏ. Phản ứng âm tính: không chuyển màu.
Phản ứng MR
Cấy vi khuẩn vào môi trường nước VP-MR, nuôi ở 370C. Sau 24 giờ, nhỏ vào 5 giọt dung dịch thuốc thử và đọc kết quả.
Loại gà Số mẫu
Gà 1 tuần tuổi 6
Gà 1 tháng tuổi 6
Gà đẻ 12
17 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu đỏ. Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng.
Phản ứng VP
Cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường VP-MR, nuôi cấy ở 370C. Sau 48 giờ, nhỏ vào môi trường nuôi cấy trên 0,6 ml dung dịch 1 và 0,2 ml dung dịch 2. Đọc kết quả sau 15 phút và 1 giờ.
- Phản ứng dương tính: môi trường có màu đỏ hồng đậm.
- Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng hoặc không biến màu.
Sử dụng citrat
Cấy vi khuẩn vào thạch simon citrat nuôi ở 370C từ 18 giờ đến 24 giờ. Vi khuẩn sử dụng citrat (dương tính) làm môi trường chuyển sang màu xanh nước biển, âm tính khi môi trường giữ nguyên màu xanh lá cây.
Tiến hành thực hiện phương pháp đĩa kết hợp trên môi trường MHA để xác định vi khuẩn E. coli ESBL, các bước thực hiện như sau:
Chuẩn bị ống nghiệm có chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng và đĩa petri có thạch MHA. Cấy vi khuẩn từ đĩa NA cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý, lắc đều và so độ đục với độ đục chuẩn Mac Farland 0.5 có chứa 108CFU/ml.
Dùng tampon vô trùng nhúng vào huyễn dịch vi khuẩn, ép vào thành ống cho bớt dịch rồi phết đều lên trên mặt thạch MHA. Chờ sau khi mặt thạch khô tiến hành đặt 4 đĩa kháng sinh lên trên bề mặt đĩa sao cho khoảng cách giữa 2 đĩa kháng sinh từ 23-25 mm. Đĩa 1 chứa ceftaxidime 30 ( g), đĩa 2 chứa ceftaxidime + acid clavulanic (30µg/10µg), đĩa 3 chứa ceftotaxime (30 g) và đĩa 4 chứa ceftotaxime+ acid clavulanic (30µg/10µg).
Đem đĩa ủ ở nhiệt độ 370
C trong 24 giờ. Đo v ng vô khuẩn của 4 đĩa kháng sinh, nếu đường kính của đĩa 2 trừ đường kính đĩa 1 và đĩa 4 trừ đĩa 3 lớn hơn hoặc bằng 5 mm thì khẳng định đây là E. coli ESBL.
18 Mẫu Swab
Mac conkey agar (MC) có bổ sung kháng sinh cefatazidime (2mg/l)
Cấy thuần 10 khuẩn lạc qua môi trường Nutrient agar (NA)
Thử sinh hóa IMViC (++--) hoặc AIPIE20
Khẳng định E. coli
Phƣơng pháp đĩa kết hợp
Đo đường kính vòng vô khuẩn nếu có sự khác biệt giữa đĩa 1 và 2, đĩa 3 và 4 > 5mm
E. coli ESBL
Hình 3.3 Quy trình phân lập E. coli ESBL 370C 24 giờ
370C 18-24 giờ 1
Đĩa 1: cefatazidime (30μg)
2
Đĩa 2: cefatazidime +acid clavulanic (30μg/10μg)
4
Đĩa 4: cefotaxime + acid clavulanic (30μg)
3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
19
Hình 3.2 Phản ứng IMViC định danh vi khuẩn E. coli
Ghi chú:
ống nghiêm 1: thử nghiệm citrate âm tính ống nghiệm 2: thử nghiệm VP âm tính ống nghiệm 3: thử nghiệm MR dương tính ống nghiệm 4: thử nghiệm indol dương tính
3.3 Phƣơng pháp lập kháng sinh đồ
Lập kháng sinh đồ bằng phương pháp khuếch tán trên thạch theo Kirbry- Bauer. Đề tài thử nghiệm 13 loại kháng sinh và xác định các loại kháng sinh nhạy, trung bình và kháng dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng (mm) theo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2014 được trình bày bảng 3.2.
Chuẩn bị canh khuẩn: vi khuẩn E. coli ESBL được pha thành huyển dịch vi khuẩn có độ đục tương đương với độ đục khuẩn Macfarland 0.5 (108 CFU/ml, sau đó pha loãng bằng nước muối sinh lý 9 để được huyễn dịch vi khuẩn có độ đục 106 CFU/ml
Tiến hành
Cấy huyễn dịch vi khuẩn lên thạch MHA bằng cách dùng tampon vô trùng nhúng vào huyễn dịch vi khuẩn (106 CFU/ml), sau đó chan đều lên khắp mặt thạch MHA dưới ngọn đèn cồn để tránh tạp nhiễm. Chờ cho mặt thạch khô gắp lấy các kháng sinh đặt nhẹ lên mặt thạch. Đặt các kháng sinh sao cho hai đĩa kháng sinh cách nhau 2,5-3,5cm và cách mép thạch 2-2,5cm, phải đảm bảo các đĩa kháng sinh tiếp xúc thẳng với mặt thạch (1 đĩa thạch MHA đặt tối đa 7 loại
20
kháng sinh). Các đĩa được lật úp lại sau khi đặt kháng sinh. Sau đó đem ủ ở 370C trong 24 giờ, đọc kết quả.
Huyễn dịch vi khuẩn
MHA, đặt các đĩa kháng sinh ủ 16-18 giờ/370C
Đo đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Đọc kết quả kháng sinh nhạy, kháng và trung gian dựa vào chuẩn đường kính vòng kháng khuẩn theo CLSI (2014)
21
Bảng 3.2 Tiêu chuẩn đường kính vòng kháng khuẩn của một số loại kháng sinh CLSI 2014
Kháng sinh
Hàm lƣợng
Đƣờng kính vùng ức chế (mm) Nhạy Trung gian Kháng
Ampicillin 10 µg ≥17 14-16 ≤13 Cefuroxime 30 µg ≥23 15-22 ≤14 Cefaclor 30 µg ≥18 15-17 ≤14 Gentamycin 10 µg ≥15 13-14 ≤12 Streptomycin 10 µg ≥15 12-14 ≤11 Kanamycin 30 µg ≥18 14-17 ≤13 Amikacin 30 µg ≥17 15-16 ≤14 Tetracycline 30 µg ≥15 12-14 ≤11 Doxycycline 30 µg ≥14 11-13 ≤10 Norfloxacin 10 µg ≥17 13-16 ≤12 Ofloxacin 5 µg ≥16 13-15 ≤12 Fosfomycin 50 µg ≥16 13-15 ≤12 Ceftazidime-clavulanic 30/10 µg ≥18 13-15 ≤12
Amoxicillin + acid clavulanic 20/10 µg ≥18 14-17 ≤13
Trimethoprim +Sulfamethoxazol 5 µg ≥16 11-15 ≤10
3.4 Thống kê và xử lí số liệu
Số liệu so sánh tỉ lệ nhiễm giữa các loại gà bằng phương pháp chi bình phương (χ2), sử dụng phần mềm thống kê Minitab 16.
22
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả khảo sát E.coli ESBL trên gà
4.1.1 Kết quả khảo sát E.coli ESBL trên gà thịt khỏe (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lấy 12 mẫu phân thu thập từ 12 gà thịt khỏe, gồm 6 gà thịt 1 tuần tuổi và 6 gà thịt 1 tháng tuổi, kiểm tra tỉ lệ nhiễm E.coli ESBL bằng phương pháp đĩa kết hợp, kết quả được thể hiện qua bảng 4.1.
Bảng 4.1 Tỉ lệ dương tính với E. coli ESBL gà thịt khỏe
Loại gà Số mẫu khảo sát Số mẫu dương tính Tỉ lệ (%)
Gà thịt 1 tuần tuổi 6 4 66,7a
Gà thịt 1 tháng tuổi 6 6 100a
Tổng 12 10 83,33
Những giá trị trong cùng một cột mang những chữ mũ giống nhau thì sai khác nhau không có ý nghĩa thống kê.
Kết quả bảng 4.1 cho thấy gà thịt 1 tháng tuổi có tỉ lệ nhiễm E.coli ESBL cao hơn gà thịt 1 tuần tuổi. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Kết quả này phù hợp với kết quả của Nahla M.S et al. (2014) đã phân lập được 128
mẫu E. coli ESBL từ 145 mẫu phân gà thịt ở tỉnh Sulaimania, Iraq chiếm tỉ lệ
88,3%. Vì sau khi được sinh ra một thời gian ngắn (khoảng 24 giờ) trong đường tiêu hóa của gia súc non đã xuất hiện E. coli và một số loại vi sinh vật gây bệnh (Links et al., 2005). Gà con ở tuần tuổi đầu tiên khi nở thiếu đáp ứng miễn dịch một cách đầy đủ do vậy nhạy cảm cao với các bệnh truyền nhiễm ( Vũ Duy Giảng, 2009) cộng thêm lây nhiễm vi khuẩn từ lò ấp. do đó, khả năng gà dưới một tuần tuổi tiếp xúc với vi khuẩn E. coli ESBL có sẵn trong môi trường hoặc từ gà mẹ truyền qua tiếp xúc với trứng là rất cao và tạo nên hệ vi khuẩn E. coli ESBL trong đường ruột.
Ngày nay, thuốc kháng sinh được sử dụng rộng rãi như một chất kích thích tăng trưởng và điều trị các bệnh truyền nhiễm ( Wolfgang 1998). Và thuốc kháng sinh được bổ sung vào trong khẩu phần ăn uống của gà định kỳ và thường xuyên. Do đó tuổi gà càng cao thì tiếp xúc với kháng sinh càng nhiều. Điều này lý giải vì sao tỉ lệ nhiễm E. coli ESBL trên gà thịt 1 tháng tuổi cao hơn so với gà thịt 1 tuần tuổi.
23
4.1.2 Kết quả khảo sát E. coli ESBL trên gà thịt và gà đẻ khỏe
Lấy 24 mẫu phân thu thập từ 24 con gà khỏe, gồm 12 gà thịt và 12 gà đẻ kiểm tra tỉ lệ nhiễm E.coli ESBL giữa 2 nhóm này. Kết quả được thể hiện qua bảng 4.2.
Bảng 4.2 Tỉ lệ dương tính với ESBL trên gà thịt và gà đẻ khỏe
Loại gà Số mẫu khảo sát Số mẫu dương tính Tỉ lệ (%)
Gà thịt 12 10 83,33a
Gà đẻ 12 1 8,3b
Tổng 24 11 45,8
Những giá trị trong cùng một cột mang những chữ mũ khác nhau thì sai khác nhau có ý nghĩa thống kê.
Tỉ lệ nhiễm ESBL trên gà theo bảng 4.2 là 45,8% . Tỉ lệ này cao hơn ở Nigieria khi Sunday Akidarju Mamza et al. (2010) khảo sát số mẫu swab phân gà 9/89 mẫu đạt tỉ lệ 4,9%. Sự khác biệt giữa tỉ lệ nhiễm giữa gà thịt và gà đẻ có ý nghĩa thống kê. Kết quả trên cho thấy tỉ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli ESBL trên gà thịt (83,33%) cao hơn ở gà đẻ (8,3%). Điều này có thể do mật độ nuôi của gà thịt thì cao hơn gà đẻ. Theo Phạm Kim Đăng et al. (2012) qua điều tra tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà của cả 3 loại mô hình chăn nuôi (nông hộ, gia trại và trang trại), kết quả cho thấy tính theo hướng sản xuất thì tỉ lệ sử dụng kháng sinh để phòng trị bệnh cho gà thịt cao hơn gà đẻ. Ngoài ra theo Johann D. Pitout et al (2005) do gen mã hóa sinh ESBL nằm trên plasmid, có khả năng lan truyền ngang, các loài vi khuẩn có thể truyền cho nhau gen sinh ESBL một cách nhanh chóng dù chỉ qua một thế hệ, làm cho chủng loại và số lượng vi khuẩn có thể lan rộng nhanh chóng.
24
4.2 Kết quả tính nhạy cảm của vi khuẩn E. coli ESBL với kháng sinh
4.2.1 Kết quả tính nhạy cảm của E. coli ESBL đối với kháng sinh trên gà 1 tuần tuổi
Bảng 4.3 Tỉ lệ kháng kháng sinh trên gà 1 tuần tuổi
Tên kháng sinh
Số KL kiểm tra
Kháng Trung gian Nhạy
Số KL Tỉ lệ (%) Số KL Tỉ lệ (%) Số KL Tỉ lệ (%) Ampicillin 12 12 100 0 0 0 0 Cefuroxime 12 11 92 1 8 0 0 Cefaclor 12 12 100 0 0 0 0 Gentamycine 12 12 100 0 0 0 0 Streptomycine 12 12 100 0 0 0 0 Kanamycine 12 8 67 1 8 3 25 Amikacin 12 0 0 0 0 12 100 Tetracyline 12 5 41,7 4 33,33 3 25 Doxycyline 12 0 0 1 8 11 92 Norfloxacin 12 4 33,33 4 33,33 4 33,33 Fosfomycin 12 0 0 0 0 12 100 Trimethoprim +Sulfamethoxazole 12 11 92 0 0 1 8 Ofloxacin 12 8 67 3 25 1 8
Từ kết quả kháng sinh đồ thực hiện trên gà 1 tuần tuổi theo bảng 4.3 cho thấy ESBL kháng với kháng sinh ampicillins, cefaclor, gentamycine, streptomycine với tỉ lệ cao 100%. Hai loại kháng sinh trung gian là tetracyline và norfloxacin với tỉ lệ 33,33%, ta cũng dễ dàng thấy ESBL nhạy với amikacin và fosfomycin với tỉ lệ 100%, doxycyline cũng có tỉ lệ nhạy cao (92%). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả kháng sinh đồ ở bảng 4.3 so sánh với một số tác giả cùng nghiên cứu về độ nhạy cảm của kháng sinh E. coli ESBL trên gà có một số điểm tương đồng, tuy nhiên cũng có một số khác biệt cụ thể như sau:
Kết quả nghiên cứu ở bảng 4.3 cho thấy nhóm kháng sinh tetracycline nhạy cảm tương đối với E. coli ESBL ( 41.7%). Tuy nhiên có rất nhiều kết quả nghiên cứu khác cho thấy vi khuẩn E. coli đề kháng rất cao với tetracycline là 100% trong kết quả nghiên cứu của Đỗ Võ Anh Khoa và Lưu Hữu Mãnh (2012) và Mohammad Tabatabaei (2010), đồng thời đề kháng rất cao trong nghiên cứu của M.J. Islam (2008) là 96,6% và Olufemi (2012) là 76,9%.
25
Kết quả bảng 4.3 cho thấy E. coli ESBL đề kháng mạnh nhóm beta-lactam gồm có kháng sinh ampicillin (100%), cefuroxime (92%), cefalor (100%). Đồng thời đề kháng với 2 kháng sinh nhóm aminoglycoside là gentamycin (100%) và streptomycine (100%).
Đối với kháng sinh Trimethoprim + sulfamethoxazole:trong nghiên cứu ở bảng 4.3 kết quả cho thấy vi khuẩn E. coli ESBL đề kháng cao với tỉ lệ 92% và tương đồng với nghiên cứu của Tanvir Bashar et al (2011) là 100%. Tuy nhiên, nghiên cứu này cao hơn so với nghiên cứu của Robab và Azadeh (2003) là 50%, Rezvan Moniri và Kamran Dastehgoli (2005) là 70,7% và Zainabu Hamisi et al
(2012) là 53,25%.
Đối với những kháng sinh có khả năng nhạy cảm với vi khuẩn E. coli
ESBL: kết quả 4.3 cho thấy nhạy cảm tốt với một số kháng sinh thuộc nhóm kháng sinh aminoquinolons, doxycyline và fosfomycin là amikacin (100%), doxycycline (92%) và fosfomycin (100%). Điều này tương đồng với nghiên cứu của Lê Văn Đồng trên đàn vịt chạy đồng tỉnh Trà Vinh năm 2011 cũng cho thấy vi khuẩn E. coli nhạy cảm mạnh với kháng sinh amikacin (97,92%), fosfomycin (85,42%).
Bảng 4.4. Kiểm tra tính đa kháng của E. coli ESBL trên gà 1 tuần tuổi Số loại
kháng sinh đề kháng
Số khuẩn lạc kiểm tra (n = 12)
Kiểu hình đa kháng Số đa
kháng Tỉ lệ (%) Tỉ lệ chung (%) 6 Am+Cr+Ge+Sm+Nr+Of Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Bt 1 1 8,33 8,33 16,66 7 Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Kn+Bt 2 16,67 16,67 8 Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Kn+Bt+Of Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Kn+Te+Bt 2 1 16,67 8,33 25 9 Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Kn+Te+Bt+Of Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Kn+Nr+Bt+Of Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Te+Nr+Bt+Of 2 1 2 16,67 8,33 16,67 41,67
Dựa vào bảng 4.4 số lại kháng sinh đề kháng trên gà 1 tuần tuổi là từ 6-9 loại chủ yếu là các kháng sinh ampicillin, cefuroxime, cefaclor, gentamycine, streptomycine, kanamycine, tetracyline, norfloxacin, trimethoprim, ofloxcin
26
Kết quả trên cho ta thấy số loại đa kháng ở gà 1 tuần tuổi chiếm tỉ lệ cao nhất là 9 loại (41,6%). Từ đó có thể nói vi khuẩn E. coli ESBL đã kháng rất nhiều loại kháng sinh, làm cho công tác tìm kháng sinh điều trị càng gặp nhiều khó khăn hơn.
4.2.2 Kết quả tính nhạy cảm của E. coli ESBL đối với kháng sinh trên gà 1 tháng tuổi
Bảng 4.5 Tỉ lệ kháng kháng sinh trên gà 1 tháng tuổi
Tên kháng sinh
Số KL kiểm tra
Kháng Trung gian Nhạy
Số KL Tỉ lệ (%) Số KL Tỉ lệ (%) Số KL Tỉ lệ (%) Ampicillin 18 18 100 0 0 0 0 Cefuroxime 18 18 100 0 0 0 0 Cefaclor 18 18 100 0 0 0 0 Gentamycine 18 17 94 1 6 0 0