- Thiết bị nghiên cứu
2.2.5Phương pháp xác định khả năng phòng và chữa ung thư của SBVN trên chuột được u thực nghiệm
Để xác định một hoạt chất có khả năng phòng, chống ung thư, phải xác định 3 tiêu chí sau:
1. Khả năng ức chế sự phát triển của khối u sơ cấp của hoạt chất; 2. Mức độ di căn của khối u khi được uống hoạt chất;
3. Khả năng kéo dài tuổi thọ động vật khi được uống phòng trước và uống sau khi đã có u sơ cấp so với đối chứng không được uống hoạt chất.
Liều lượng SBVN sử dụng cho thí nghiệm được xác định sau khi có được liều độc cấp LD50 (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm), theo đó liều sử dụng sẽ thấp hơn liều độc cấp 10 lần. Trong trường hợp không xác định được liều độc cấp thì liều SBVN sử dụng sẽ được tham khảo từ giá trị độc tế bào IC50
(Inhibition concentration) kiểm tra in-vitro trên tế bào LLC. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển). Chất thử nào có IC50 < 20µM (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hoá học) hoặc IC50 ≤ 20µM với hoạt chất tinh khiết sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư [71]. Như vậy liều gây chết động vật là 20 lần so với liều gây chết tế bào.
Sau khi chúng tôi thu được kết quả từ phương pháp gây u ung thư cho chuột bằng dòng tế bào LLC nhận thấy; Khi sử dụng tế bào LLC để gây ung thư trên chuột, các khối u xuất hiện sớm và di căn đa dạng tới nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể với hiệu quả cao hơn so với gây u ung thư bằng hóa chất. Vì thế, chúng tôi chọn dòng tế bào này cho các thí nghiệm kiểm chứng khả năng phòng chống ung thư của hoạt chất SBVN.
Chuột thí nghiệm được gây u bằng dòng tế bào ung thư LLC.
Động vật thí nghiệm: 45 chuột BALB/c khoẻ mạnh được chia làm 9 lô (5 chuột/lô), được nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học:
- Lô 1: uống SBVN liều 500mg/kgP/ngày trước 4 tuần sau đó tiêm tế bào LLC để gây u và vẫn tiếp tục cho uống SBVN thêm 6 tuần nữa.
- Lô 2: uống SBVN liều 1000mg/kgP/ngày trước 4 tuần sau đó tiêm tế bào LLC để gây u và vẫn tiếp tục cho uống SBVN thêm 6 tuần nữa.
- Lô 3 : Tiêm tế bào LLC để gây u, sau khi có u sơ cấp, uống ngay SBVN liều 500mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần tiếp theo.
- Lô 4: Tiêm tế bào LLC để gây u, sau khi có u sơ cấp, uống ngay SBVN liều 1000mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần tiếp theo.
- Lô 5 : Tiêm tế bào LLC để gây u, sau khi có u sơ cấp, uống ngay SBVN liều 1500mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần tiếp theo.
- Lô 6: Tiêm tế bào LLC để gây u, sau khi có u sơ cấp, uống ngay SBVN liều 2000mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần tiếp theo.
- Lô 7: Tiêm tế bào LLC để gây u, sau khi có u sơ cấp, uống ngay SBVN liều 2500mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần tiếp theo.
- Lô 8: Tiêm tế bào LLC để gây u, sau khi có u sơ cấp, uống ngay SBVN liều 3000mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần tiếp theo.
- Lô 9: (đối chứng dương): chỉ tiêm tế bào LLC và cho uống dung dịch sinh lý là dung môi được sử dụng để pha SBVN trong suốt thời gian thực hiện thí nghiệm.
Như vậy, với thiết kế thí nghiệm như trên, chúng tôi sẽ kiểm tra được khả năng bảo vệ cơ thể của SBVN trước khi gây u bằng tế bào ung thư LLC ở các liều lượng khác nhau (lô 1, 2). Đồng thời, sau khi chuột đã xuất hiện u do bị tiêm tế bào ung thư LLC, chuột được dùng SBVN như chất chữa trị hay ức chế khối u ở các liều lượng khác nhau (lô 3, 4, 5, 6, 7, 8). Lô 9, sử dụng như là đối chứng dương cửa thí nghiệm.
Theo dõi chuột hàng ngày, cân khối lượng hàng tuần theo phương pháp của Abrham (1978), đo kích thước khối u tại vị trí tiêm theo phương pháp của Ligo và
cộng sự (1991) để xác định khả năng ức chế khối u của SBVN. Thể tích khối u được tính như sau:
V = a × b2/2
Trong đó: V: thể tích khối u; a: chiều dài khối u; b: đường kính khối u