3. Đối tượng nghiờn cứu
3.3.2.2. Mẫu phõn tớch
Để xỏc định hàm lượng vitamin A trong sữa ta cần phải xử lý mẫu và bơm vào mỏy HPLC.
- Xử lý mẫu sơ bộ: cỏc mẫu sữa ở trong hộp được lắc kỹ, dựng pipet lấy mỗi mẫu là 5ml cho vào bỡnh đựng tam giỏc 100ml:
+ Mẫu 1 sữa Vinamilk + Mẫu 2 sữa Mộc chõu + Mẫu 3 sữa Ba vỡ
+ Mẫu 4 sữa Ba vỡ (sau khi đun cỏch thủy thỡ cho thờm chất chuẩn vào)
- Xà phũng cỏc mẫu bằng cỏch: thờm 2g KOH, 0.5g acid ascorbic (vitamin C) (để quỏ trỡnh oxi húa khụng bị mất vitamin A) và 30mL etanol.
- Dựng mỏy lắc rung đều dung dịch mẫu khoảng 30 phỳt. - Đun sụi cỏch thủy 30 phỳt
- Để nguội
- Mẫu 4 cho thờm 1,7ml chất chuẩn cú nồng độ 5ppm đó pha từ trước - Sau đú cho vào phễu chiết để chiết mẫu:
Ở đõy ta chiết nguội: thờm vào 40ml dietylete lắc đều 1(giờ), để yờn 1(giờ) để dung dịch phõn lớp, sau đú đem chiết. Giữ lại phần phớa trờn, loại bỏ phần dưới. Sau đú lại thờm vào 40ml dietylete lắc đều 1(giờ), để yờn 1(giờ) để dung dịch phõn lớp, sau đú đem chiết. Loại bỏ phần dưới, phần trờn cho vào 100ml nước cất hai lần khử ion, lắc đều 45 phỳt và để yờn 45 phỳt cho phõn lớp. Chiết cho đến khi dựng giấy quỳ thử dung dịch phớa dưới khụng cũn màu xanh của kiềm thỡ dừng lại (thường 5 lần)
Chỳ ý: Khi lắc chiết phải mở nắp để thoỏt khớ trong bỡnh chiết, nghiờng phễu chiết khi lắc để dung dịch khụng bị chảy ra ngoài.
- Dịch phớa trờn thu được lọc qua phễu cú chứa Na2SO4 khan mục đớch để hấp thụ nước cũn dư. Cho vào bỡnh quả lờ. Đem cất quay chõn khụng ở nhiệt độ 40 – 41oC, tốc độ vũng gần tối đa, thời gian cất khoảng 15 phỳt đến khi cụ cạn hoàn toàn. Nếu sau khi cất quay cú lẫn chất bộo thỡ đem hỳt chõn khụng sau đú thổi khớ N2 để bay sạch dung mụi cũn lại.
- Hũa tan trong bỡnh quả lờ bằng vài ml Metanol
- Định mức chớnh xỏc cỏc mẫu tới 10ml bằng metanol (lắc đều 15 giõy và siờu õm 3 phỳt). Lọc dung dịch thu được qua màng lọc dung mụi 13mm - 0,45μm. Thu dịch lọc vào vial dựng cho HPLC, tiờm vào mỏy. Cú ghi cỏc ký hiệu của mỗi mẫu.
Giai đoạn làm sạch cột chiết pha rắn (SPE):
Chuẩn bị SPE lờn bộ hỳt chõn khụng. Hoạt húa SPE lần lượt với 20ml Methanol và 20ml nước cất. Bỏ dịch chảy ra từ SPE. Tiếp tục lại rửa bỡnh với 20ml nước cất cho vào SPE. Sau đú hỳt chõn khụng liờn tục qua SPE cho đến khụ cột..
Chuyển toàn bộ dịch chiết trờn vào SPE, trỏng ống ly tõm2 lần với 2 mL dung dịch MeOH rồi đưa tiếp vào SPE. Khụng để cột khụ trong giai đoạn này.
Đưa ống ly tõm 50ml vào hứng dịch từ mỗi ống SPE. Tiếp đú rửa giải vitamin A từ SPE bằng 6ml MeOH chảy qua cột với tốc độ 0,8 ml/phỳt, hỳt đến hết dịch chảy ra khỏi SPE và hỳt chõn khụng thờm 10 giõy. Định mức dịch thu được đến vạch bằng nước cất để đảm bảo thu hết được dịch rửa giải. Sau đú, lọc dịch cuối qua màng lọc trước khi bơm vào mỏy HPLC bằng filer 0,45μm.
