3. Đối tượng nghiờn cứu
3.3.2.1. Chất chuẩn gốc
Vitamin A acetate 98.5%
Bảo quản: Chuẩn gốc bảo quản tại -18±4oC, hạn sử dụng dựa theo khuyến cỏo của nhà sản xuất. Tất cả cỏc dung dịch chuẩn phải được chuẩn bị trước khi phõn tớch.
- Cõn 1,00 mg chất chuẩn Vitamin A acetate (M=328,49) vào bỡnh tam giỏc 100ml , tiến hành xà phũng húa để cú dung dịch chuẩn Retinol (M=286,5) tương ứng cú nồng độ 100 mg/l trong metanol.
- Xà phũng chất chuẩn bằng cỏch: thờm 2g KOH, 0.5g acid ascorbic (vitamin C) (để quỏ trỡnh oxi húa khụng bị mất vitamin A) và 30mL etanol.
- Dựng mỏy lắc rung hũa tan dung dịch mẫu chuẩn khoảng 30 phỳt. Mẫu sau khi sử lý
Cột C18 đó được làm sạch HPLC Rửa giải Màng lọc Cụ đặc Cụ đặc MeOH MeOH MeOH
- Đun sụi cỏch thủy 30 phỳt
- Sau đú cho vào phễu chiết để chiết mẫu chuẩn:
+ Nếu mẫu chuẩn đem chiết núng: để cỏc hợp chất hữu cơ tan tốt hơn thỡ cho thờm nước vào lắc chiết, loại bỏ lớp nước phớa dưới, giữ lại lớp phớa trờn. Thờm vào 40ml dietylete lắc đều 1(giờ), để yờn 1(giờ) để dung dịch phõn lớp, sau đú đem chiết. Giữ lại phần phớa trờn, loại bỏ phần dưới. Sau đú lại thờm vào 40ml dietylete lắc đều 1(giờ), để yờn 1(giờ) để dung dịch phõn lớp, sau đú đem chiết. Loại bỏ phần dưới, phần trờn cho vào 100ml nước cất hai lần khử ion , lắc đều 45 phỳt và để yờn cho phõn lớp 45 phỳt. Chiết cho đến khi dựng giấy quỳ thử dung dịch phớa dưới khụng cũn màu xanh của kiềm thỡ dừng lại.
+ Nếu mẫu chuẩn để nguội: Thờm vào 40ml dietylete lắc đều 1(giờ), để yờn 1(giờ) để dung dịch phõn lớp, sau đú đem chiết. Giữ lại phần phớa trờn, loại bỏ phần dưới. Sau đú lại thờm vào 40ml dietylete lắc đều 1(giờ), để yờn 1(giờ) để dung dịch phõn lớp, sau đú đem chiết. Loại bỏ phần dưới, phần trờn cho vào 100ml nước cất hai lần khử ion, lắc đều 45 phỳt và để yờn 45 phỳt cho phõn lớp. Chiết cho đến khi dựng giấy quỳ thử dung dịch phớa dưới khụng cũn màu xanh của kiềm thỡ dừng lại (thường 3-4 lần)
Chỳ ý: Khi lắc chiết phải mở nắp để thoỏt khớ trong bỡnh chiết, nghiờng phễu chiết khi lắc để dung dịch khụng bị chảy ra ngoài.
- Dịch phớa trờn thu được lọc qua phễu cú chứa Na2SO4 khan mục đớch để hấp thụ nước cũn dư. Rồi cho vào bỡnh quả lờ. Đem cất quay chõn khụng ở nhiệt độ 40 – 41oC, tốc độ vũng gần tối đa, thời gian cất khoảng 15 phỳt đến khi cụ cạn hoàn toàn. (Nếu sau khi cụ quay cú lẫn chất bộo thỡ đem hỳt chõn khụng sau đú thổi khớ N2 để bay sạch dung mụi cũn lại ).
- Hũa tan trong bỡnh quả lờ bằng vài ml Metanol
- Định mức mẫu chuẩn về nồng độ gốc 100mg/l bằng Metanol. Để đạt nồng độ 100mg/l thỡ định mức mẫu chuẩn đó cụ cạn đến 10ml bằng Metanol (vỡ khối lượng mẫu ban đầu lấy là 1mg) lắc đều 15 giõy và siờu õm 3 phỳt.
Dung dịch chuẩn làm việc từ dung dịch chuẩn gốc: lần lượt pha loóng bằng metanol
+ Lấy 0,1ml chuẩn gốc chuẩn đến 10ml được nồng độ chuẩn 1: 1mg/l hoặc 1ppm + Lấy 0,5ml chuẩn gốc chuẩn đến 10ml được nồng độ chuẩn 1: 5mg/l hoặc 5ppm + Lấy 1ml chuẩn gốc chuẩn đến 10ml được nồng độ chuẩn 1: 10mg/l hoặc 10ppm Lắc đều 15 giõy và siờu õm 3 phỳt. Lọc dung dịch thu được qua màng lọc dung mụi 13mm - 0,45μm. Thu dịch lọc vào vial dựng cho HPLC, tiờm vào mỏy. Cú ghi cỏc ký hiệu của mỗi mẫu chuẩn.