3. Đối tượng nghiờn cứu
1.4.3. Phương phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Đối với cỏc vitamin A hoạt động và đặc tớnh của retinol và carotenoid trong cỏc mẫu sinh học, độ phõn giải LC rừ ràng, độ chớnh xỏc và độ tin cậy cao, khả năng ỏp dụng rộng rói trờn nhiều loại chế phẩm.
a. Phương phỏp sắc ký lỏng trực tiếp
Cú thể ỏp dụng đối với cỏc nguyờn liệu vitamin A tổng hợp, cỏc thành phẩm chứa vitamin A tổng hợp mà trong thành phần chỉ chứa vitamin A ở một dạng ester đồng nhất hoặc dạng retinol.
Tiến hành theo phương phỏp sắc ký lỏng
Pha động: Methanol - ethyl acetat - nước (90: 7: 3). Dung dịch thử:
Lấy chớnh xỏc một lượng chế phẩm cú chứa khoảng 4000 IU vitamin A cho vào bỡnh định mức dung tớch 100 ml, thờm ethanol, lắc kỹ rồi thờm ethanol đến định mức, lắc đều, lọc.
Dung dịch chuẩn:
Pha chất chuẩn vitamin A (dạng giống với dung dịch thử: retinol, retinyl acetat, retinyl palmitat … trong ethanol để thu được dung dịch chuẩn cú nồng độ vitamin A chớnh xỏc khoảng 40 IU/ml.
Điều kiện sắc ký:
Cột thộp khụng gỉ (25 cm ì 4 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 àm hoặc 10 àm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước súng 325 nm.
Tốc độ dũng: 1,5 ml/min đến 2,0 ml/min. Thể tớch tiờm: 20 àl
Cỏch tiến hành:
Kiểm tra khả năng thớch hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của diện tớch pic thu được trờn sắc ký đồ của 6 lần tiờm lặp lại mẫu chuẩn (RSD) khụng được lớn hơn 2,0 %.
Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
b. Phương phỏp sắc ký lỏng sau khi thủy phõn
Cú thể ỏp dụng đối với nguyờn liệu vitamin A tổng hợp dạng bột, dạng dầu và dạng nhũ tương
Pha động: Hỗn hợp methanol - nước (95: 5). Dung dịch thử:
Dung dịch thử A:
Đối với nguyờn liệu dạng bột: Lấy chớnh xỏc một lượng chế phẩm cú chứa khoảng 120000 IU vitamin A cho vào bỡnh định mức dung tớch 50 ml. Thờm khoảng 20 mg đến 30 mg bromelains, 20 mg đến 30 mg BHT , 2,0 ml nước và 0,15 ml isopropanol. Làm núng trong cỏch thủy ở 60 oC đến 65 oC trong thời gian 2 đến 5 phỳt. Làm lạnh tới 30 °C rồi thờm 20 ml dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd 0,1 M trong iso-ropanol. Lắc siờu õm 5 phỳt. Thờm isopropanol đến vạch, lắc đều (lắc xoay trũn, trỏnh tạo bọt khớ).
Đối với nguyờn liệu dạng dầu hoặc nhũ tương: Lấy chớnh xỏc một lượng chế phẩm cú chứa khoảng 120000 IU vitamin A cho vào bỡnh định mức dung tớch 50 ml, hũa tan ngay trong 5 ml pentan. Thờm khoảng 20 mg đến 30 mg BHT và 20 ml dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd 0,1 M trong isopropanol. Lắc siờu õm 5 phỳt. Thờm isopropanol (TT) đến vạch, lắc đều (lắc xoay trũn, trỏnh tạo bọt khớ).
Dung dịch thử B:
Cho khoảng 20 mg đến 30 mg BHT (TT) vào bỡnh định mức dung tớch 50 ml, thờm 5 ml isopropanol (TT), lắc cho tan, thờm 5,0 ml dung dịch thử A, thờm isopropanol (TT) tới vạch, lắc đều, lọc.
Dung dịch chuẩn:Dung dịch chuẩn A:
Cõn chớnh xỏc một lượng chất chuẩn retinyl acetat tương đương với 120000 IU vitamin A cho vào bỡnh định mức dung tớch 50 ml. Thờm ngay 5 ml pentan, thờm
khoảng 20mg đến 30mg BHT và 20 ml dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd 0,1 M trong isopropanol. Lắc siờu õm 5 phỳt. Thờm iso-propanol đến vạch, lắc đều (lắc xoay trũn, trỏnh tạo bọt).
Dung dịch chuẩn B:Cho khoảng 20 mg đến 30 mg BHT (TT) vào bỡnh định mức dung tớch 50 ml, thờm 5 ml isopropanol , lắc cho tan, thờm 5,0 ml dung dịch chuẩn A rồi thờm isopropanol đến vạch, lắc đều.
Điều kiện sắc ký:
Cột thộp khụng gỉ (25 cm ì 4 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 àm hoặc 10 àm). Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước súng 325 nm.
Tốc độ dũng: 1 ml/min. Thể tớch tiờm: 20
c. Phương phỏp sắc ký lỏng sau khi chiết tỏch vitamin A
Cú thể ỏp dụng đối với cỏc chế phẩm phức tạp và cú chứa vitamin A với hàm lượng thấp khụng thực hiện được 1 trong 2 phương phỏp trờn.
Tiến hành bằng phương phỏp sắc ký lỏng Pha động: Hỗn hợp methanol - nước (97: 3) Điều kiện sắc ký:
Cột thộp khụng gỉ (25 cm ì 4 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 àm hoặc 10 àm). Tốc độ dũng: 1 ml/min.
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước súng 325 nm. Thể tớch tiờm: 10 àl.
Dung dịch thử:
Lấy chớnh xỏc một lượng chế phẩm cú chứa khoảng 2000 IU vitamin A đem xà phũng húa, chiết và bay hơi dịch chiết đến cắn giống như phương phỏp 2. Hũa tan cắn thu được và chuyển hỗn hợp sang bỡnh định mức 50 ml với isopropanol.
Dung dịch chuẩn gốc:
Hũa tan chất chuẩn retinyl acetat trong isopropanol để thu được dung dịch cú nồng độ chớnh xỏc khoảng 1000 IU vitamin A trong 1 ml. Xỏc định nồng độ chớnh xỏc của dung dịch chuẩn gốc bằng cỏch pha loóng trong isopropanol tới nồng độ 10
đến 15 IU trong 1 ml rồi đo độ hấp thụ ở bước súng 326 nm trong cốc đo dày 1 cm, dựng isopropanol làm mẫu trắng.