Khóa luận đã sử dụng nguyên liệu là curcumin chiết xuất từ cây nghệ vàng Khóa luận cũng sử dụng các nguyên vật liệu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị của phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược – Bộ môn Công nghiệp Dược, bao gồm:
Bảng 2.1: Danh mục các hóa chất, dung môi
STT Nguyên liệu Nguồn gốc 1 Anhydrid acetic Merck 2 Acid butyric Trung Quốc 3 Acid propionic Trung Quốc 4 Dicloromethan Trung Quốc
5 Ethanol Trung Quốc
6 Ethylacetat Trung Quốc
7 Methanol Trung Quốc
8 Natri carbonat Trung Quốc 9 Natri hydroxid Trung Quốc
10 Nước cất Việt Nam
11 Natri sulfat Trung Quốc
12 Aceton Trung Quốc
Bảng 2.2: Danh mục các dụng cụ, thiết bị
STT Thiết bị, dụng cụ Xuất xứ 1 Bản mỏng silicagel GF254 Đức 2 Bình chiết 250 mL Đức 3 Bình cầu 1 cổ, 2 cổ, 3 cổ 50 mL, 100 mL Đức
4 Bộ lọc hút chân không Buchner Trung Quốc 5 Cân kĩ thuật Sartorius BP 2001S Thụy Sĩ 6 Cốc có mỏ 100 mL Đức
7 Giấy lọc Việt Nam
8 Máy cất quay chân không Buchi R210 Thụy Sĩ 9 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Mỹ 10 Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer Mỹ 11 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-
NMR) Bruker AV-500
Mỹ
12 Máy đo phổ khối lượng LTQ Orbitrap XL TM Mỹ 13 Máy đo phổ khối lượng 1100 Series LC /MSD Trap Mỹ 14 Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt IKA Đức
15 Ống đong 25mL, 50 mL, 100 mL Trung Quốc 16 Pipet chia vạch 1mL, 5 mL, 10 mL Trung Quốc 17 Nhiệt kế thủy ngân Trung Quốc 18 Tủ sấy Memmert Đức
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM với hệ dung môi thích hợp và đo nhiệt độ nóng chảy, xác định Rf mỗi sản phẩm.
Xác định cấu trúc sản phẩm bán tổng hợp được bằng cách đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)
Thử tác dụng kháng khuẩn và chống nấm:
Giống VSV kiểm định
Giống VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh- sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
Vi khuẩn Gram (-)
Escherichia coli ATCC 25922 E. coli
Proteus mirabilis BV 108 P. mirabilis
Shigella flexneri DT 112 S. flexner
Salmonella typhi DT 220 S. typhi
Vi khuẩn Gram (+)
Staphylococcus aureus ATCC 1128 S. aureus
Bacillus pumilus ATCC 10241 B. pumilus
Bacillus subtilis ATCC 6633 B. subtilis
Bacillus cereus ATCC 9946 B.cereus
Sarcina lutea ATCC 9341 S. lutea
Vi nấm
Mốc đen: Aspergillus sp. VSSH 1401 Asp.1 Mốc xanh 1: Aspergillus sp. VSSH 1402 Asp.2 Mốc xanh 2: Paecilomyces sp. VSSH 1403 Pae. 3
Mốc xanh 3: Penicillium sp. VSSH 1501 Pen. 1
Môi trường thử nghiệm
Bảng 2.3.. Môi trường nuôi cấy VK Môi trường Thành phần Môi trường canh thang nuôi cấy VK kiểm
định
NaCl 0,5%; pepton 0,5%; cao thịt 0,3%; nước vđ 100mL
Môi trường thạch thường NaCl 0,5%; pepton 0,5%; cao thịt 0,3%; thạch 1,6%;nước vđ 100mL Môi trường Sabouraud pepton 1%; glucose 2%; thạch
1,6%; nước vđ 100mL
Mẫu kháng sinh chuẩn
Streptomycin : 20 IU/ml đối với vi khuẩn Gr(-).
Benzathin penicillin: 20 IU/ml đối với vi khuẩn Gr(+).
Kháng sinh chống nấm itraconazol 300 μg/ml pha trong methanol.
Phương pháp thử
(Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán)
Nguyên tắc: mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định (vi khuẩn, vi nấm), hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn (vô nấm).
Tiến hành:
- Mẫu thử được pha vào dung môi thích hợp (dicloromethan) với nồng độ cho các mẫu như sau : Trang H1: 150 μg / mL, Trang2: 170 μg / mL, Trang 3: 170 μg / mL, curcumin : 170 μg / mL. Các khoanh giấy lọc vô trùng và được sấy khô, được tẩm 3 lần với dung dịch mẫu thử, sau mỗi lần tẩm khoanh giấy lọc chứa mẫu thử đều được sấy < 60% ͦC đến khô hết dung môi.
- Chuẩn bị môi trường và cấy VSV kiểm định:
Vi khuẩn kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, rồi ủ cho phát triển trong tủ ấm 37 ͦC trong thời gian 18-24h đến nồng độ 107 tế bào / ml (kiểm tra bằng pha loãng và dẫy dịch chuẩn), (nấm mốc được nuôi trên môi trường Saubouraud thạch
nghiêng ở 28 ͦC trong 5 ngày, rồi sử dụng dung dịch xà phòng 0,2% vô trùng đính lấy bào tử với nồng độ 105 bào tử/ ml). Môi trường thạch thường ( cũng như Saubouraud cho vi nấm) vô trùng (tiệt trùng 118 ͦC/ 30 phút) được làm lạnh về 45 - 50 ͦC và được cấy giống VSV kiểm định vào với tỉ lệ 2,5 ml / 100 ml. Lắc tròn để VSV kiểm định phân tán đều trong MT thạch, rồi đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể tích 20 ml/ đĩa và để cho đông lại.
- Đặt mẫu thử và chứng : khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử ( cũng như các khoanh tẩm kháng sinh chứng chuẩn) và xử lý như trên được đặt lên bề mặt môi trường thạch (thạch thường cũng như Saubouraud ) chứa VSV kiểm định theo sơ đồ định sẵn.
- Ủ các đĩa Petri có mẫu thử và chứng được đặt như trên trong tủ ấm ở t ͦC= 37 ͦC đối với vi khuẩn (28- 30 ͦC với vi nấm) trong 18-24h với vi khuẩn và 24-72h đối với vi nấm, sau đó đọc kết quả. Đo đường kính vòng vô khuẩn (vô nấm) nếu có bằng thước kẹp Panmer độ chính xác 0,02 mm.
- Đánh giá kết quả: dựa trên đường kính vòng vô khuẩn theo công thức:
D = n D n i i 1 s = 1 ) ( 1 2 n D n i i D D
: đường kính trunh bình vòng vô khuẩn ,vô nấm. Di : Đường kính vòng vô khuẩn ,vô nấm thứ i
s : Độ lệch thực nghiệm có hiệu chuẩn n: Số thí nghiệm làm song song (n =3)
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phản ứng acyl hóa
Acyl hóa curcumin với các tác nhân anhydrid acetic, propionyl clorid, butyryl clorid.
Sử dụng phương pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM) với bản mỏng silicagel GF254
Merck 70-230 mesh và hệ dung môi thích hợp, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm để theo dõi tiến triển của phản ứng.
Kết tinh thu sản phẩm.
2.3.2. Kiểm tra độ tinh khiết
Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM trên bản mỏng silicagel GF254
Merck 70- 230 mesh với hệ dung môi thích hợp, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt.
2.3.3. Xác định cấu trúc
Dựa trên các kết quả phân tích phổ IR, MS, 1H-NMR.
- Phổ hồng ngoại (IR): phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer với kĩ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1. Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
- Phổ khối lượng (MS): Được ghi theo phương pháp ESI tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy đo phổ khối lượng 1100 S1100 Series LC/MSD Trap.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.4. Thử tác dụng sinh học
Thử tác dụng kháng khuẩn, chống nấm của sản phẩm bán tổng hợp được bằng phương pháp khuếch tán trên thạch trên một số chủng vi khuẩn, vi nấm, được thực hiện tại Bộ môn Vi sinh – Sinh học – Trường Đại học Dược Hà Nội.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. BÁN TỔNG HỢP CÁC DẪN CHẤT CURCUMIN
Khóa luận đã tiến hành phản ứng acyl hóa curcumin với ba tác nhân chính là anhydrid acetic, propinoyl clorid, butyryl clorid. Trong đó anhydrid có sẵn ở bộ môn, propionyl clorid và butyryl clorid được điều chế từ acid propionic và butyric tương ứng.
3.1.1. Tổng hợp 4,4’-di-O-acetyl curcuminvới tác nhân anhydrid acetic
Sơ đồ phản ứng:
Tiến hành phản ứng:
Hòa tan 0,20 g NaOH (5 mmol) vào 10ml nước cất trong bình cầu một cổ dung tích 50 ml, làm lạnh. Cho 0,92 g curcumin (2,5 mmol) vào bình cầu trên, khuấy trong 5 phút. Sau đó, thêm 5 ml anhydrid acetic (0,053 mol) vào hỗn hợp trên, khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng. Theo dõi quá trình phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 30: 1 để xác định diễn biến phản ứng và thời gian thu được sản phẩm với hiệu suất cao nhất.
Sau 3h, kết thúc phản ứng, trên SKLM cho 2 vết dự đoán là 4-O-acetyl curcumin và 4,4’-di-O-acetyl curcumin (Ia) với tỉ lệ khoảng 0,5: 9,5, không còn vết nguyên liệu curcumin.
Xử lý phản ứng:
- Chiết lấy sản phẩm trong hỗn hợp với dicloromethan:
Hỗn hợp phản ứng được chuyển sang bình chiết dung tích 100 ml, chiết 3 lần với dicloromethan với thể tích lần lượt là: 20 ml, 15 ml và 10 ml. Gộp dịch chiết dicloromethan và rửa với nước cất, kiểm tra pH pha nước đến khi đạt pH khoảng 6-7 thì dừng.
Pha dung dịch NaOH 0,001M ,làm lạnh dung dịch NaOH trong tủ lạnh. Tiến hành rửa dịch chiết dicloromethan 3 lần với thể tích NaOH lần lượt là 30 ml, 30 ml, 15 ml. Theo dõi hiệu quả rửa trên SKLM bằng cách chấm 2 pha DMHC và pha nước lên cùng 1 bản mỏng, chạy trong hệ dung môi dicloromethan: methanol = 30: 1 thì sau 3 lần rửa với dung dịch NaOH, pha DMHC còn lại chỉ 1 vết đúng như dự kiến.
Sau khi rửa loại tạp, tiếp tục rửa loại kiềm dư bằng nước cất đến khi pH pha nước ̴ 7 thì dừng lại.
Làm khan dịch chiết dichloromethan bằng 2g Na2SO4 trong 1h. Sau đó lọc, đem cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ khoảng 40 ͦC.
- Kết tinh, thu sản phẩm:
Hòa tan cắn thu được vào một lượng nhỏ cồn tuyệt đối, để kết tinh trong ngăn mát tủ lạnh. Sau 24h, lọc hút chân không thu tinh thể, sấy 30 phút dưới đèn hồng ngoại.
Kết quả:
m = 1,01 g.
Cảm quan : tinh thể hình kim, màu vàng rơm.
Hiệu suất : 89%.
Nhiệt độ nóng chảy : 169,3 ͦC - 170,5 ͦC.
Khả năng hòa tan trong các dung môi: tan tốt trong các dung môi CH2Cl2, CHCl3, tan ít trong methanol, kém tan trong cồn, rất khó tan trong nước.
Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 30: 1 thấy vết rõ dưới ánh sáng đèn tử ngoại, Rf = 0,73 (CHCl3: MeOH = 20:1).
3.1.2. Phản ứng acyl hóa curcumin với tác nhân clorid acid
Điều chế tác nhân clorid acid bằng phản ứng của acid tương ứng với thionyl clorid:
Chuẩn bị:
Bình cầu 2 cổ dung tích 100 ml, phễu nhỏ giọt, sinh hàn, một bộ phận bẫy khí, bộ phận ngăn ẩm, một cốc đựng dung dịch kiềm loãng, thiết bị cất, nhiệt kế thủy ngân, 2 bình nón có nút mài.
Bố trí dụng cụ thí nghiệm như sơ đồ sau:
Hình 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phản ứng điều chế tác nhân clorid acid
Sơ đồ phản ứng:
Tiến hành phản ứng:
Cho 21,5 ml (0,3 mol) thionyl clorid vào bình cầu 3 cổ, dùng pipet chia vạch hút acid carboxylic (22,5 ml đối với acid propionic ( 0,3 mol); hoặc 23ml đối với acid butyric (0,25 mol)) vào phễu nhỏ giọt. Đun cách thủy phản ứng ở nhiệt độ khoảng 90 ͦC, nhỏ từ từ acid vào bình cầu trong 30-40 phút. Sau khi toàn bộ acid đã nhỏ hết, tiếp tục đun. Kiểm tra để kết thúc phản ứng khi không còn bọt khí nổi lên ở cốc đựng dung dịch kiềm. Cất phân đoạn thu sản phẩm, đối với propionyl clorid thu ở 77 ͦC- 79ͦC, đối với butyryl clorid thu ở 100 ͦC- 101 ͦC.
3.1.2.1.Tổng hợp 4,4’-di-O- propionyl curcuminvới tác nhân propionyl clorid.
Sơ đồ phản ứng:
Tiến hành phản ứng:
Làm khan aceton bằng Na2CO3, rồi đặt trong ngăn mát tủ lạnh 30 phút. Hòa tan 0,92g curcumin (2,5 mmol) vào 30 ml aceton đã làm khan và lạnh ở trên trong 1 bình cầu 3 cổ dung tích 100 ml. Thêm vào 1g Na2CO3. Khuấy trong 5 phút. Sau đó nhỏ từ từ 4,5 ml propionyl clorid ( 0,05 mol) vào bình cầu trong khoảng 3h. Khuấy ở nhiệt độ phòng, theo dõi quá trình phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 30: 1.
Sau 5h, kết thúc phản ứng, trên SKLM cho 2 vết, dự đoán là 4-O-propionyl curcumin và 4,4’-di-O- propionyl curcumin (Ib) với tỉ lệ khoảng 1: 9, không còn vết nguyên liệu curcumin.
Xử lý phản ứng:
- Chiết thu sản phẩm trong hỗn hợp với ethyl acetat:
Hỗn hợp phản ứng được đem cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ 50 ͦC, cắn được chiết trong 2 pha ethyl acetat, nước với tỉ lệ 3: 1 (30 : 10 ml). Pha nước được chiết lại 2 lần với ethyl acetat, mỗi lần 20 ml. Gộp dịch chiết trong ethyl acetat lại, rửa bằng nước cất đến khi pH pha nước đạt ̴ 7 thì dừng lại.
- Loại tạp tan trong kiềm:
Pha dung dịch NaOH 1mM, pH=11, làm lạnh dung dịch NaOH trong tủ lạnh. Tiến hành rửa dịch chiết ethyl acetat 3 lần với thể tích NaOH lần lượt là 30 ml, 30 ml, 15 ml. Theo dõi hiệu quả rửa trên SKLM bằng cách chấm 2 pha DMHC và pha nước lên cùng 1 bản mỏng, chạy trong hệ dung môi dicloromethan: methanol = 30: 1 thì sau 3 lần rửa với dung dịch NaOH, pha DMHC còn lại chỉ 1 vết đúng như dự kiến.
Sau khi rửa loại tạp, tiếp tục rửa loại kiềm dư bằng nước cất đến khi pH pha nước ̴ 7 thì dừng lại.
Làm khan dịch chiết trong ethyl acetat bằng 2g Na2SO4 . Lắc trong 30 phút, lọc lấy dịch, cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ khoảng 70 ͦC. - Kết tinh, thu sản phẩm:
Cắn thu được hòa tan trong cồn 96 ͦ, để kết tinh trong ngăn mát tủ lạnh, sau 20h, lọc hút chân không thu tinh thể, sấy dưới đèn hồng ngoại.
Kết quả:
m = 0,96 g.
Cảm quan: tinh thể hình kim, màu vàng.
Hiệu suất: 80%.
Nhiệt độ nóng chảy: 129,1 ͦC- 130,4 ͦC.
Khả năng hòa tan trong các dung môi: tan tốt trong CHCl3, CH2Cl2, ethyl acetat, aceton, ít tan trong methanol, ethanol, rất ít tan trong nước.
Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 30: 1 thấy vết rõ dưới ánh sáng đèn tử ngoại, Rf =0.80 ( CHCl3: MeOH = 20:1)
3.1.2.2. Tổng hợp 4,4’-di-O-butyryl curcumin với tác nhân butyryl clorid
Sơ đồ phản ứng:
Tiến hành phản ứng:
Làm khan aceton bằng Na2CO3, rồi đặt trong ngăn mát tủ lạnh 30 phút. Hòa tan 0,73g curcumin (2 mmol) vào 30 ml aceton đã làm khan và lạnh ở trên trong 1 bình cầu 3 cổ dung tích 100 ml. Thêm vào 1g Na2CO3. Khuấy trong 5 phút. Sau đó nhỏ từ từ 6,2ml butyryl clorid ( 0,06 mol) vào bình cầu trong khoảng 3h. Khuấy ở nhiệt độ phòng, theo dõi quá trình phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 30: 1.
Sau 7,5h, kết thúc phản ứng, trên SKLM cho 2 vết dự đoán là mono-O-butyryl curcumin và 4,4’-di-O-butyryl curcumin (Ic) với tỉ lệ khoảng 1: 9, không còn vết nguyên liệu curcumin.
Xử lý phản ứng:
Tương tự như với tác nhân propionyl clorid.
Kết quả:
m= 0,83 g.
Cảm quan : bột màu vàng.
Hiệu suất : 82 %
Nhiệt độ nóng chảy: 150 ͦC- 151.3 ͦC
Khả năng hòa tan trong các dung môi : tan tốt trong CHCl3, CH2Cl2, ethyl acetat, aceton, ít tan trong methanol, ethanol, rất ít tan trong nước.
Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với hệ dung môi dicloromethan: methanol = 30: 1 thấy vết rõ dưới ánh sáng đèn tử ngoại, Rf =0,794 (CHCl3: MeOH = 20:1)
3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
Để xác định cấu trúc của sản phẩm, chúng tôi đã tiến hành ghi và phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H- NMR). Kết quả phổ được trình bày cụ thể như sau:
3.2.1. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ đồ IR của sản phẩm ( Ia, Ib, Ic) được trình bày ở phụ lục 1.1 , 1.2, 1.3..Kết quả