2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thủy tinh, thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử sụng SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silica gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký người ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4.
Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 và RP18 F254 (Merck-Đức). Các vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi hiện màu.
2.2.2. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột là phương pháp sắc ký phổ biến, đơn giản nhất. Chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, DIANION. Chúng được nhồi vào cột (cột có
Tô Yến Ngọc 20 K37C- Khoa Hóa Học
thể bằng thủy tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Kích thước của chất càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên, hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được) có thể xảy ra nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ, tốc độ chảy càng giảm. Khi đó, người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều dài cột (L) thể hiện khẳ năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể.
Trong sắc ký, Rf được gọi là tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.
Tùy theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ chất so với chất hấp phụ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 - 1/10), tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất) mà hệ số này trong khoảng 1/20 - 1/30.
Trong sắc ký cột tùy vào lượng chất và dạng chất sẽ có các phương pháp khác nhau để có thể đưa chất lên cột. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột: - Cách 1: Nhồi cột khô.
Chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột.
Tô Yến Ngọc 21 K37C- Khoa Hóa Học
Chất hấp phụ được hòa tan vào trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không để bọt khí bên trong (nếu có bọn khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và cột không được nứt, gãy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc, còn nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách.
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều.
Sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài là nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon). Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
2.3.1. Phổ 1H-NMR
Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần.
2.3.2. Phổ 13C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0-230ppm.
Tô Yến Ngọc 22 K37C- Khoa Hóa Học 2.3.3. Phổ 2D-NMR
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ 1H-1H COSY (1H-1H Chemiscal Shif Correlation Spectroscosy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
2.4. Dụng cụ và thiết bị
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm: Bình chiết 30 lít, máy cô quay chân không, đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 368 nm, tủ sấy chân không, máy sấy, micropipette, bình sắc ký loại phân tích và điều chế, cột sắc ký pha thường và pha ngược các loại đường kính, dung dịch thuốc thử, bếp điện.
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Được đo trên máy Bruker
AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tô Yến Ngọc 23 K37C- Khoa Hóa Học
2.5. Hoá chất
+ Silica gel pha thường 60 (0,04 - 0,063 mm) Merck, Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30 - 50 m, Fujisilisa Chemical Ltd).
+ Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), bản mỏng tráng sẵn pha đảo RP18 F254s (Merck), bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
+ Các loại dung môi hữu cơ như methanol, ethylacetate, chlorofoc, n- hexane, acetone, v.v...
Tô Yến Ngọc 24 K37C- Khoa Hóa Học
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM
3.1. Phân lập các hợp chất
Lá cây chòi mòi Antidesma ghaesembilla được phơi khô, nghiền nhỏ thu được 2,0 kg bột khô. Bột này được ngâm chiết bằng methanol nóng (3 lần) bằng thiết bị chiết siêu âm (50oC, 3 h). Các dịch chiết methanol (MeOH) được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 100,0 g cặn chiết MeOH. Cặn chiết này được phân bố vào nước nóng và tiến hành chiết lần lượt với chlorofoc (CHCl3)và ethyl acetate (EtOAc) thu được cặn CHCl3 (AT1, 20,0 g), EtOAc (AT2, 30,5 g) và dịch nước (AT3).
Dịch nước AT3 được đưa lên cột DIANION, rửa với nước cất để loại muối rồi tiến hành rửa giải gradient với hệ dung môi có độ phân cực giảm dần MeOH/H2O 0/100100/0 (v/v) thu được 3 phân đoạn AT3A (4,3 g), AT3B (5,2 g) và AT3C (7,1 g).
Phân đoạn AT3C (7,1 g) được tiếp tục phân tách trên sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải CHCl3/MeOH/H2O (5/1/0,1,v/v/v) thu được 4 phân đoạn AT3C1-AT3C4. Tinh chế phân đoạn AT3C2 (1,8 g) bằng sắc ký cột pha đảo sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH/ H2O (1/3, v/v) kết hợp với sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải CHCl3/MeOH (5/1, v/v) thu được các hợp chất 1 (AT5) (11,0 mg) và 2 (AT6) (13,0 mg). Hợp chất 3 (AT9) (15,0 mg) được tinh chế từ phân đoạn AT3C3 (1,2 g) bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải MeOH-H2O (1/3, v/v).
Tô Yến Ngọc 25 K37C- Khoa Hóa Học
Sơ đồ 1: Sơ đồ phân lập
3.2. Tính chất hóa lí của các hợp chất phân lập được
Ampelopsisionoside (1): Chất dầu không màu; công thức phân tử:
C19H32O8 (M = 388); 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD).
Icarisde B1 (2): Chất dầu không màu; công thức phân tử: C19H30O8 (M = 386); 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD).
Alangioside A (3): Chất dầu không màu; công thức phân tử: C19H34O8 (M=390); 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD);
Tô Yến Ngọc 26 K37C- Khoa Hóa Học
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác định cấu trúc hợp chất 1: Ampelopsisionoside
Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1
Hợp chất 1 nhận được dưới dạng dầu không màu. Trên phổ proton 1H- NMR của hợp chất 1 xuất hiện tín hiệu đặc trưng của 2 nhóm metyl bậc 3 [δH 0,95 (3H, s), 1,00 (3H, s)]; 2 nhóm metyl bậc 2 [δH 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz) và 1,34 (3H, d, J = 6,0 Hz)]; 2 proton nối đôi [δH 5,93 (1H, dd, J = 6,0 Hz và 7,0 Hz) và 5,75 (1H, d, J = 6,0 Hz); 4,46 (1H, t, J = 6,0 Hz ), 2,28 (1H, m)] và 2 nhóm metilen [δH 2,89 (d, J = 13,6 Hz); 1,84 (1H, dd, J = 6,0 Hz và 13,5 Hz); 2,46 (1H, m), 2,14 (1H, m)]. Ngoài ra còn thấy xuất hiện tín hiệu của proton anome [δH 4,37 (1H, d, J = 7,5 Hz)] và các proton oximetin vùng đường trong khoảng 3,21-3,85 ppm.
Tô Yến Ngọc 27 K37C- Khoa Hóa Học
Hình 4.1.2: Phổ 1H-NMR hợp chất 1
Trên phổ cacbon 13C-NMR và DEPT của hợp chất 1 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 19 nguyên tử cacbon trong đó có 1 tín hiệu cacbonyl tại δC 215,03; 2 tín hiệu CH nối đôi [δC 134,8 và 133,99]; 2 tín hiệu cacbon bậc 4 [δC 77,78 và 43,96]; 2 nhóm metin [δC 77,96 và 37,76]; 2 nhóm metylen [δC 52,43 và 46,16]; 4 nhóm metyl [δC 25,35, 25,00, 21,46, 16,46]. Ngoài ra các tín hiệu đặc trưng cho phân tử đường cũng xuất hiện với 1 cacbon anome ở δC 102,60 và các nhóm oximetilen và oximetin của đường trong khoảng 62,68 - 78,11.
Tô Yến Ngọc 28 K37C- Khoa Hóa Học
Hình 4.1.3: Phổ 13C-NMR hợp chất 1
Kết quả phân tích trên gợi ý về 1 khung megastigmane có gắn 1 phân tử đường glucoside cho hợp chất này. Phân tích các tương tác nhận được trên phổ 2 chiều HSQC và HMBC cho phép gán chính xác các giá trị phổ NMR. Các tín hiệu proton được gán với các tín hiệu cacbon tương ứng dựa vào kết quả phân tích phổ HSQC. Tương tác HMBC giữa H-7 (δH 5,75) với các tín hiệu C-5 (37,76), C-6 (77,78), C-8 (134,90), C-9 (77,96); giữa H-8 (5,93) với C-7 (133,99), C-9 (77,96); giữa H-9 (δH 4,46) với C-8 (134,90), C-10 (21,46), C-1' (δC 102,60) và H-1' (δH 4,37) với C-9 (δC 77,96) chỉ ra phân tử đường glucoside gắn với khung megastigmane tại C-9.
Tô Yến Ngọc 29 K37C- Khoa Hóa Học
Hình 4.1.4: Phổ HSQC hợp chất 1
Hình 4.1.5: Phổ HMBC hợp chất 1
Kết hợp so sánh dữ kiện phổ của hợp chất Ampelopsisionoside [24] thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị trí tương ứng. Từ đó, hợp chất 1 được xác định là Ampelopsisionoside có CTPT: C19H32O8 với số khối tương ứng M=388.
Tô Yến Ngọc 30 K37C- Khoa Hóa Học
Tô Yến Ngọc 31 K37C- Khoa Hóa Học
Bảng 4.1: Số liệu phổ NMR của chất 1 và chất tham khảo
C [24]δC δCa,b DEPT δHa,c (J, Hz) HMBC
1 43,9 43,96 C - - 2 52,4 52,43 CH2 1,84 (dd,2,0,13,5) 2,89 (d, 13,5) 1, 3, 6, 11 3 214,9 214,9 C - - 4 45,9 46,16 CH2 2,15 (m), 2,47 (m) 3, 5, 6, 13 5 37,7 37,76 CH 2,29 (m) 13 6 77,8 78,06 C - - 7 133,7 133,99 CH 5,75 (d, 16,0) 5, 6, 8, 9 8 134,8 134,90 CH 5,92 (dd,7,0,16,0) 7, 9, 10 9 77,6 77,78 CH 4,47 (br t, 6,0) 8, 10, 1' 0 21,4 21,46 CH3 1,34 (d, 6,0) 8, 9 1 24,8 25,00 CH3 0,95 (s) 1, 2, 6, 12 2 25,2 25,35 CH3 1,00 (s) 1, 2, 6, 11 3 16,3 16,46 CH3 0,92 (d, 6,5) 4, 5, 6 1' 102,5 102,60 CH 4,37 (d, 7,5) 9 2' 75,1 75,56 CH 3,21 (m) 1', 3' 3' 77,8 78,11 CH 3,38 (m) 2', 4' 4' 71,3 71,56 CH 3,33 (m) 3', 6' 5' 77,7 77,96 CH 3,25 (m) 4' 6' 62,5 62,68 CH2 3,67 (dd,5,5,12,0) 3,85 (dd,2,5,12,0) 5', 6' a
Tô Yến Ngọc 32 K37C- Khoa Hóa Học
4.2. Xác định cấu trúc hợp chất 2: Icarisde B1
Hình 4.2.1: Cấu trúc của hợp chất 2
Hợp chất 2 nhận được dưới dạng dầu không màu.Trên phổ proton 1H- NMR của hợp chất 2 xuất hiện tín hiệu đặc trưng của 2 nhóm metyl bậc 3 [δH 1,17 (3H, s), 1,40 (3H, s)], 1 nhóm methyl bậc 2 [δH 1,41 (3H, s)] và 1 nhóm methyl gắn với nối đôi liên hợp C=O [δH 2,21 (3H, s)]; 2 nhóm metin [δH 5,85 (1H, s) , 4,36 (1H, t, J = 6,0 Hz)] và 2 nhóm metilen [δH 1,41 (1H, m); 1,49 (1H, m); 2,11 (1H, m), 2,39 (1H, m)]. Ngoài ra còn thấy xuất hiện tín hiệu của proton anome [δH 4,46 (1H, d, J = 8,0 Hz)] và các proton oximetin vùng đường trong khoảng 3,18 - 3,90 ppm.
Hình 4.2.2: Phổ 1H-NMR hợp chất 2
Trên phổ cacbon 13C-NMR và DEPT của hợp chất 2 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 19 nguyên tử cacbon trong đó có 1 cacbon của allene tại δC
Tô Yến Ngọc 33 K37C- Khoa Hóa Học
211,52, 1 nhóm cacbonyl tại δC 200,95, 3 cacbon bậc 4 [δC 120,07, 72,39 và 37,01]; 2 nhóm metin [δC 101,16 và 72,58]; 2 nhóm metylen [δC 48,11 và 46,60]; 4 nhóm metyl [δC 32,24, 30,79, 29,40, 26,54]. Ngoài ra các tín hiệu đặc trưng cho phân tử đường cũng xuất hiện với 1 tín hiệu cacbon anome đặc trưng của 1 phân tử đường ở δC 102,65 và các nhóm oximetin của đường trong khoảng 62,72 - 78,11.
Hình 4.2.3: Phổ 13C-NMR hợp chất 2
Kết quả phân tích trên gợi ý về 1 khung megastigmane có gắn 1 phân tử đường glucoside. Phân tích các tương tác nhận được trên phổ 2 chiều HSQC và HMBC cho phép gán chính xác các giá trị phổ NMR. Các tín hiệu proton được gán với các tín hiệu cacbon tương ứng dựa vào kết quả phân tích phổ HSQC. Tương tác HMBC giữa H-8 (δH 5,85) với các tín hiệu C-6 (δC 120,07), C-7 (δC 211,52), C-9 (δC 200,95), C-10 (δC 26,54); giữa H-10 (δH 2,21) với C- 8 (δC 101,16), C-9 (δC 200,95), đặc biệt tương tác giữa H-1' (δH 4,46) với C-3 (δC 72,58) khẳng định phân tử đường glucoside được gắn với khung megastigmane tại C-3.
Tô Yến Ngọc 34 K37C- Khoa Hóa Học
Hình 4.2.4: Phổ HSQC hợp chất 2
Tô Yến Ngọc 35 K37C- Khoa Hóa Học
Kết hợp so sánh dữ kiện phổ của Icarisde B1 [23] thấy hoàn toàn phù
hợp tại các vị trí tương ứng. Từ đó, hợp chất 2 được xác định là Icarisde B1 có CTPT: C19H30O8 với số khối tương ứng M=386.
Tô Yến Ngọc 36 K37C- Khoa Hóa Học
Bảng 4.2: Số liệu phổ NMR của chất 2 và chất tham khảo
C #δC [23] δCa,b DEPT δHa,c (J, Hz) HMBC
1 37,0 37,01 C - - 2 48,1 48,11 CH2 1,49 (m) 2,11 (m) 1, 3, 4, 6 3 72,5 72,58 CH 4,36 (m) - 4 46,6 46,60 CH2 1,41 (m) 2,39 (m) 2, 3, 5, 6 5 72,4 72,39 C - 6 120,0 120,07 C - 7 211,5 211,52 C - - 8 101,2 101,16 CH 5,85 (s) 6, 7, 9, 10 9 200,9 200,95 C - - 10 26,5 26,54 CH3 2,21 (s) 8, 9 11 32,2 32,24 CH3 1,17 (s) 1, 2, 6, 12 12 29,4 29,40 CH3 1,40 (s) 1, 2, 3, 11 13 30,8 30,79 CH3 1,41 (s) 4, 5, 6 1' 102,6 102,65 CH 4,46 (d, 8,0) 3 2' 75,1 75,08 CH 3,18 (dd, 7,5, 8,0) 1', 3' 3' 78,1 78,11 CH 3,39 (t, 9,0) - 4' 71,6 71,63 CH 3,38 (overlap) 3' 5' 77,9 77,88 CH 3,38 (m) - 6' 62,7 62,72 CH2 3,63 (m) 3,90 (m) -
Tô Yến Ngọc 37 K37C- Khoa Hóa Học
4.3. Xác định cấu trúc hợp chất 3: Alangioside A
Hình 4.3.1: Cấu trúc của hợp chất 3
Hợp chất 3 nhận được dưới dạng chất dầu không màu. Phổ proton 1H-
NMR của hợp chất 3 xuất hiện tín hiệu đặc trưng của 2 nhóm metyl bậc 3 [δH 0,90 (3H, s), 0,99 (3H, s)], 2 nhóm methyl bậc 2 [δH 0,82 (3H, d, J = 7,0) và 1,31 (3H, d, J = 6,0)]; 2 proton nối đôi [δH 5,80 (1H, d, J = 16,0 Hz) và 5,62 (1H, dd, J = 6,5 và 16,0 Hz)]; 3 nhóm metin [δH 4,40 (1H, m), 3,67 (1H, dd, J
= 5,0 và 11,5), 1,94 (m)]; 2 nhóm metilen [δH 1,41 (2H, m) và 1,67 (2H, m)]. Ngoài ra còn thấy xuất hiện tín hiệu của proton anome [δH 4,35 (1H, d, J = 7,5 Hz)] và các proton oximetin vùng đường trong khoảng 3,20-3,84 ppm.