3. Nội dung nghiên cứu
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số
-
(1994), Anwan (1997). Quy trình tách chiết DNA :
- Lá chè tươi thu về rửa sạch sau đó tiến hành tách chiết ngay.
- Nghiền 0,2 g lá chè trong cối chày sứ (cối chày sứ vô trùng giữ ở tủ - 20oC) với nitơ lỏng cho đến khi thành dạng bột mịn. Bổ sung vào mẫu đệm rửa có thành phần (Tris - HCl 100 mM, pH = 8,0; EDTA 5 mM, pH 8,0; NaH2PO4 0,4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
%; sorbitol 350 mM; H2O). Chia ra các ống eppendorf 1,5 ml. Li tâm 12000 vòng/phút, 15 phút, 4o ại 2 lần.
- Bổ sung 800 l đệm chiết có thành phần Tris - HCl 100 mM, pH = 8,0; EDTA 20 mM, pH = 8,0; CTAB 4 %; NaCl 1,4 M; H2O, lắc đều và giữ ở 650C trong thời gian 30 phút đến 1 tiếng, 5 phút lắc đều 1 lần.
- Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút, rồi bổ sung 800 l Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc đều trong thời gian 10 phút. - Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 4oC.
- Dùng pipet chuyển dịch nổi sang ống eppendorf 2 ml.
- Bổ sung một thể tích tương đương Isopropanol (lạnh) và đảo nhẹ, giữ mẫu trong đá 10 phút.
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 4oC.
- Loại dịch nổi, rửa DNA bằng cách thêm 500 l cồn 80 %, ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 4oC (bước này thực hiện 2 lần), sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol.
- Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không, rồi hòa tan trong 200 l H2O khử ion.
- Sau khi DNA được hòa tan hoàn toàn thì bổ sung 3 l Rnase (10mg/ml). Giữ sản phẩm ở 37oC trong 2 giờ.
- Cho vào 200 l Chloroform/isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ (hỗn hợp được phân thành 2 lớp, lớp trên có chứa DNA), ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 5 phút ở 4o
C.
- Chuyển pha trên sang ống eppendorf mới và bổ sung 20 l CH3COONa 3M, cho tiếp 450 l ethanol lạnh 100% vào, lắc nhẹ và giữ sản phẩm trong đá 30 phút. - Ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 4oC.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Đổ phần dịch nổi, rửa DNA bằng 400 l ethanol 80% hai lần. Sau mỗi lần rửa ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 6 phút, sau đó loại bỏ ethanol. - Làm khô DNA bằng quạt gió hoặc hút chân không, bổ sung 50 l H2O vào sản phẩm để hòa tan DNA và giữ ở 4o
C.
- Điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8 %.
2.2.2. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose
- Chuẩn bị gel agarose 0,8%: hòa 0,8g agarose trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1X. Để nhiệt độ hạ xuống còn khoảng 50 – 60oC, đổ dung dịch agarose vào khuôn điện di đã gài sẵn răng lược thích hợp. Sau 30 - 60 phút, khi gel đã đông, đặt gel vào hộp điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel 1 - 2 mm. - Tra mẫu: lấy khoảng 5 µl mẫu trộn với khoảng 1,5 - 3 µl đệm tra mẫu (20% glycerol; Tris-HCl 100mM, pH = 8,0; EDTA 10mM, pH = 8,0; Bromophenol blue 0,25%). Tra vào các giếng trên gel.
- Tiến hành điện di trong dung dịch TAE 1 X với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 110V, thời gian 30 phút. DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương, quan sát sự di chuyển bằng màu xanh của bromophenol blue.
- Nhuộm gel bằng EtBr: bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 µl/ml trong 10 phút, sau đó nhẹ nhàng rửa sạch gel bằng nước. - Quan sát và chụp ảnh: gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm trên máy soi DNA. Quan sát thấy DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di được chụp bằng máy chụp ảnh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nguyên lý của
. Mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen
PPO có mã số trên ngân hàng Genbank (DQ513313, EF623826, EF635860, EU787433, EF650017, EF650016, JX465712, CQ192142 và FJ210643).
Bảng 2.2.Trình tự cặp mồi nhân gen PPO ở 3 mẫu chè nghiên cứu
Mồi Trình tự mồi (5’-3’) Nhiệt độ gắn mồi (oC)
Phe F TAGGATCCATGGCTTCCATTCTCCCTC 59
Phe R CGGCCTCGAGTTAAGAATCAAACTCAATC 59
Phản ứng PCR khếch đại đoạn gen PPO quan tâm được tiến hành với
thành phần được trình bày trong bảng 2.3 và chu trình nhiệt trong bảng 2.4
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng PCR nhân gen PPO
Thành phần Nồng độ ban đầu Thể tích phản ứng (µl)
Nước khử ion 16.2
Buffer 10X 2.5
MgCl2 25 mM 1
dNTPs 10 mM 1
Mồi xuôi 10 pmol/µl 1
Mồi ngược 10 pmol/µl 1
DNA khuôn 100ng 2
Taq polymerase 5U/ µl 0.3
Tổng thể tích 25
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (o
C) Thời gian Số chu kỳ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2 Biến tính 95 30 giây
32
3 Gắn mồi 59 45 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 2 phút
5 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Từ bước 2 đến bước 4 của phản ứng PCR được lặp lại 32 chu kỳ. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (EtBr), soi và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Trên cột tinh sạch sản phẩm PCR có màng chứa các phân tử ái lực cao với DNA, khi cho dịch có chứa DNA qua cột, DNA sẽ được cố định trên màng còn các thành phần khác sẽ đi qua màng và được loại bỏ. Khi bổ sung nước vào màng, DNA được hòa tan và thu lại vào ống mới bằng cách ly tâm tốc độ cao. Các bước được tiến hành the hướng dẫn của bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR do hãng Thermo Scientific cung cấp.
- : V mẫu : V binding buffe
55 oC – 65 o hoàn toàn.
- 800 l
, loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Thêm 700 l washing b .
Loại bỏ dịch chảy qua cột. -
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Hòa tan DNA trong 30 – 50 µl nước khử ion khử trùng (hoặc dung dịch Elusion buffer), để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Thu dịch.
- .
2.2.5. Tách dòng gen mã hóa PPO
Sản phẩm PCR tinh sạch sẽ được gắn vào vector tách dòng pTZ57R/T để tạo vector tổ hợp có mang đoạn gen PPO mong muốn (PPO - pTZ57R/T). Phản ứng được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, vector tái tổ hợp PPO - pTZ57R/T được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
Chọn lọc các khuẩn lạc dương tính (khuẩn lạc màu trắng) trên môi trường LB đặc (pepton, NaCl, cao nấm men, agar) có bổ sung 50 mg/l ampicillin, 30 mg/l X-gal và 0,1 mM IPTG. Sự có mặt của DNA tái tổ hợp được kiểm tra bằng phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn.
2.2.5.1. Phƣơng pháp ghép nối đoạn gen PPO vào vector tách dòng pTZ57R/T
Sản phẩm PCR (gen PPO) được ghép nối vào vector pTZ57R/T tạo
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 2.1: Hình ảnh vector pTZ57R/T
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng ghép nối gen PPO
vào vector pTZ57R/T STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước khử ion khử trùng 1,7 2 Buffer 2 3 Vector pTZ57R/T 1 4 Sản phẩm PCR (~ 70 ng/ µl) 5
5 Enzyme T4 ligase (5U / µl) 0,3
Tổng thể tích 10
Hỗn hợp phản ứng được ủ trong máy PCR 1 giờ 30 phút ở nhiệt độ 22oC. Đặt hỗn hợp phản ứng trong đá và chuẩn bị thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.5.2. Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến chủng E. coli
DH5α
Sản phẩm ghép nối gen vào vector được biến nạp vào tế bào khả biến
E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt.
Quá trình biến nạp được thực hiện như sau:
- Lấy tế bào khả biến E.coli DH5α giữ ở -20oC ra để trên đá lạnh 30 phút. - Bổ sung 5 µl DNA plasmid vào ống chứa tế bào khả biến → trộn nhẹ, để trên đá 15-20 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC, trong 1 phút → để trên đá 5 phút
- Bổ sung 500 µl môi trường LB lỏng (pepton, NaCl, cao nấm men), nuôi lắc 37oC, trong 1 giờ
- Cấy trải 50 µl trên đĩa pettri chứa LB đặc (pepton, NaCl, cao nấm men, agar) có bổ sung thêm kháng sinh ampicillin (50 µl/ml), nuôi ở 37oC qua đêm → theo dõi khuẩn lạc mọc → lựa chọn khuẩn lạc trắng để xác định khả năng chứa plasmid tái tổ hợp.
2.2.5.3. Tách chiết plasmid tái tổ hợp từ tế bào vi khuẩn
*Chuẩn bị hóa chất tách plasmid
- Sol I (đệm ly giải, bảo quản ở tủ lạnh): 50mM glucose 25mM Tris-HCl pH=8,0 10mM EDTA pH=8,0 - Sol II (phá vỡ màng tế bào): 0,2N NaOH 1% SDS
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Sol III (kết tủa protein, bảo quản ở tủ lạnh): 60ml CH3COOK 5M
11,5ml acetic acid (CH3COOH) 28,5ml H2O cất khử trùng
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy khuẩn lạc mang pTZ57 R/T - PPO trong môi trường LB lỏng có bổ sung Ampicilin 50 mg/l ở 37 oC lắc 200 vòng/ phút qua đêm. Các tế bào E.coli mang plasmid sau khi nuôi cấy đến pha cân
bằng thì được ly tâm thu cặn. * Các bước tiến hành:
- Chuyển dịch nuôi vào ống eppendort, 6 phút, 4oC.
- Loại bỏ dịch, hoà cặn tế bào vi khuẩn trong 150 l dung dịch I để lạnh hòa tan tế bào hoàn toàn.
- Bổ sung 150 l dung dịch II, đảo đầu ống eppendorf nhẹ nhàng, giữ trong đá 5 phút.
- Thêm 150
, 15 phút, 4 oC, thu dịch.
- Bổ sung 50 l CH3COONa 3M, pH = 5,2 và 1 ml EtOH 100 %, để lạnh âm
20 o , 15 phút, 4 oC, để thu DNA.
- 10 phút,
làm khô và hoà trong 30 l H2O.
- Bổ sung RNase và ủ ở 37 oC trong 1giờ để loại bỏ RNA.
- Kiểm tra độ tinh sạch bằng cách lấy 5 µl điện di trên gel agarose 0,8%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ tái tổ hợp SacI và XhoI : Bảng 2.6: Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn Thành phần Nồng độ ban đầu Thể tích phản ứng (µl) Nước khử ion 2,5 Buffer SacI 10X 1 Plasmid tái tổ hợp ~ 70 ng/ µl 6 SacI 5U/ µl 0,25 XhoI 5U/ µl 0,25 Tổng thể tích 10 2.2.6. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide
Trình tự nucleotide của gen PPO được xác định trên máy đọc trình tự
nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer của hãng Ampplied Biosystem tại Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Sử dụng bộ kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit - AppliedBiosystems (Mỹ).
2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Kết quả đọc trình tự gen được phân tích bằng phần mềm Blast và BioEdit.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÁCH DNA TỔNG SỐ TỪ CÁC MẪU CHÈ NGHIÊN CỨU
Tất cả các nghiên cứu trên gen đều được bắt đầu từ việc tách chiết một trong hai loại nucleic acid, đó là DNA và RNA. Sản phẩm tách chiết phải đảm bảo một số yêu cầu: tinh sạch, ít bị đứt gãy hay bị phân hủy bởi các tác nhân hóa học hay cơ học, lượng nucleic acid thu được phải đủ lớn đảm bảo cho việc tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Để tách DNA tổng số từ lá tươi của cây chè, chúng tôi tiến hành thu mẫu lá tươi của giống LDP1, Trung du, Keo Am Tích và tiến hành tách chiết theo phương pháp Samuel (1994), An
(1997).
agarose 0,8 %, 3.1.
1 1 2 3
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của 3 mẫu chè nghiên cứu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.1 cho thấy, DNA tổng số thu được 1 băng sáng rõ duy nhất ở các mẫu nghiên cứu, không bị đứt gẫy, không lẫn tạp chất và có thể sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. NHÂN GEN PPO Ở CÁC MẪU CHÈ NGHIÊN CỨU
Gen mã hóa PPO được cho là chỉ có trình tự mã hóa có kích thước là 1,8 kb. Trình tự gen mã hóa PPO được phân lập từ mRNA và genome ở chè đã được công bố trên Genbank với mã số DQ513313, EF623826, EF635860, EU787433, EF650017, EF650016, JX465712, CQ192142 và FJ210643 [28]. Trên cơ sở đã tách chiết được DNA tổng số có chất lượng tốt từ các mẫu lá chè nghiên cứu làm DNA khuôn tối ưu cho phản ứng PCR. Chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR với các điều kiện nhiệt độ khác nhau và nhận thấy PCR ở nhiệt độ gắn mồi tốt nhất là 59 oC với 32 chu kì. Và sau khi tối ưu được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu chúng tôi đã tiến hành nhân bản gen mã hóa PPO bằng
phản ứng (bảng 2.2) được thiết kế
dựa trên trình tự nucleotide của gen.
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím, kết quả thu được thể hiện trên hình 3.2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.2. Hình ảnh điện di kết quả PCR khuếch đại gen PPO
(M: Marker DNA 1 kb (Fermentas) 1, 2 và 3: sản phẩm PCR khuếch đại gen
PPO tương ứng từ giống Trung du, Keo Am Tích và LDP1)
Kết quả thu được ở hình 3.2 cho thấy, sản phẩm PCR ở cả 3 mẫu nghiên cứu Trung du và Keo Am Tích và LDP1 đều nhận được băng DNA có kích thước khoảng 1,8 kb, kích thước này phù hợp theo tính toán lý thuyết và tương ứng với chiều dài của gen PPO từ các công trình đã công bố [28]. Đồng thời, kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR là đặc hiệu và đủ hàm lượng sử dụng cho tách dòng gen PPO.
3.3. TÁCH DÒNG GEN PPO TỪ CÁC GIỐNG CHÈ NGHIÊN CỨU
Để ghép nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng pTZ57R/T có hiệu quả thì sản phẩm PCR phải được làm sạch để loại bỏ các thành phần tạp chất có trong sản phẩm PCR. Do vậy cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tiến hành quá trình gắn gen vào vector tách dòng. Chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR của 3 mẫu chè nghiên cứu bằng bộ kít GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo Scientific.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các đoạn gen sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng và xác định sơ bộ hàm lượng DNA tinh sạch. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch cho thấy chỉ có một băng vạch có kích thước tương ứng với sản phẩm PCR thu được.
Từ sản phẩm PCR thu được, chúng tôi tiến hành ghép nối vào vector pTZ57R/T.Hỗn hợp phản ứng ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α bằng cách sốc nhiệt ở 42 oC trong 1 phút. Sau khi biến nạp, cấy trải trên môi trường LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agar) có bổ sung thêm kháng sinh Ampicilin (50 µl/ml), IPTG (0,1 mM) và X – gal (40 mg/ml). kết quả là sự xuất hiện của những khuẩn lạc xanh và trắng.
37 oC. Sau khi nuôi, DNA plasmid được tách chiết theo quy trình các bước ở mục 2.5.2.3và kiểm tra kết quả trên gel agarose 0,8%.
Từ các plasmid thu được, để khẳng định plasmid có mang đoạn gen sản phẩm PCR hay không, chúng tôi tiến hành phân tích plasmid bằng enzyme giới hạn. Hai enzyme được lựa chọn là SacI và XhoI để phân tích dựa trên cơ sở