N (mg%) = {1,42 * (V1-V2)*100/a}*2
3.9.5Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối của các chủng
vi khuẩn được tuyển chọn
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi khuẩn. Chính vì vậy nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật là cần thiết [7],[8],[16]. Để khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn chúng tôi tiến hành nuôi cấy 3 chủng này các mức nhiệt độ khác nhau: 27oC, 32oC, 37oC, 42oC trên môi trường BMS, pH = 6,8. Sau 48h nuôi cấy tiến hành đo OD660nm xác định mật độ tế bào. Kết quả được ghi nhận tại bảng 3.13.
Bảng 3.13. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt đến sinh khối của chủng
Nhiệt độ(oC) Mật độ tế bào (tổng số tế bào x109/ml)
P. nitroreducens B. cenocepacia P.entomophila 27 1,94de 1,57f 2,17cd 32 2,86b 1,98de 3,21a 37 2,16cde 3,16a 2,35c 42 1,86e 2,69b 1,963de ANOVA Nhiệt độ ** Chủng vi khuẩn ** Nhiệt độ và VK ** LSD(Alpha=0,01) 0,275 CV% 5,91
Bảng số liệu tính theo cột dọc
Các chỉ số chữ cái giống nhau trên cùng một cột không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Rang Test.
Kết quả xử lý số liệu bảng ANOVA cho thấy sự khác biệt về sinh khối tế bào ở các mức nhiệt độ khác nhau rất có ý nghĩa về thống kê, tần số biến động chỉ số sinh khối tế bào (CV%) = 5,91). Bảng trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Rang Test mức ý nghĩa 0,01 cho thấy:
Cả 3 chủng khảo nghiệm đều có phản ứng tốt với giới hạn của nhiệt độ 27-42OC. Tuy nhiên chủng P. entomophila và P. nitroreducens khi được nuôi cấy ở nhiệt độ 27 oC bắt đầu tăng trưởng nhanh và sự tăng trưởng đạt trạng thái bảo hòa ở 32 oC, sự tăng trưởng của 2 chủng vi khuẩn này sẽ dừng lại và bắt đầu giảm nhẹ khi nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC và 42oC.
Ngược lại, sinh khối của B. cenocepacia tăng mạnh khi được nuôi cấy ở nhiệt độ 32oC và đạt trạng thái cân bằng ở 37oC.
PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu của đề tài chúng tôi có những kết luận sau:
1. Đã phân lập và mô tả đặc điểm hình thái của 31 chủng vi khuẩn cố định đạm
nội sinh trong rễ cây ngô trên môi trường vô đạm Nfb. 31 chủng phân lập được đều có khả năng sinh IAA.
2. Tuyển chọn được 9 chủng có phản ứng tốt với sự sinh trưởng, tích luỹ chlorophyll, N, P…và dương tính với gen nifH (C6, C10, C13, C14, C18, C23, C29, C30, C31).
Trong số đó đã giải trình tự gen 16S được 3 chủng C14, C23, C31 là những chủng cho hoạt tính cố định đạm, khả năng sản xuất IAA cao và dương tính với gen
nifH đó là các chủng Pseudomonas nitroreducens C14, Burkholderia cenocepacia C23, Pseudomonas entomophila C31.
Khi nhiễm các chủng này vào hệ rễ cây làm tăng số lá 23 – 33%; chiều dài lá 18,8 – 38,5%, chiều cao cây 29,5 – 44,2%; đường kính gốc thân 24,3 – 31,5%; chiều dài rễ 24,2-25,9%; khối lượng rễ 21,9 – 27%; sinh khối tươi 41,8-53,5%, sinh khối khô 48,8 – 58,8% ; tích luỹ diệp lục tổng số tăng 69,4 -84,9%; tích lũy N trong lá tăng 35,4 – 54,2%; tích luỹ P tăng 30,5 – 36,1% so với đối chứng.
3. Đã xây dựng được quy trình nuôi cấy của 3 chủng vi khuẩn tuyển chọn với các thông số sau:
Pseudomonas nitroreducens C14: Sinh trưởng tốt nhất trên BMS sau 48h nuôi
cấy với tốc độ lắc 150 -200 vòng/ phút ở pH 6,8 và nhiệt độ 32oC.
Pseudomonas entomophila C31: Sinh trưởng tốt nhất trên BMS sau 48h -72h
nuôi cấy với tốc độ lắc 150 vòng/ phút ở pH 7,8 và nhiệt độ 32oC
Burkholderia cenocepacia C23: Sinh trưởng tốt nhất trên BMS sau 48h nuôi cấy với tốc độ lắc 150 vòng/phút ở pH 6,3và nhiệt độ 37oC.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu định danh các vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô trên địa bàn tỉnh Đăk lăk có hoạt tính cố định đạm cao, có phản ứng tốt đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây ngô.
2. Nghiên cứu về những đặc tính có lợi khác của chủng Pseudomonas entomophila,
Pseudomonas nitroreducens Burkholderia cenocepacia tác động lên sự sinh trưởng và phát
triển của cây ngô trên địa bàn tỉnh Đăk Lăk làm cơ sở sản xuất các loại phân bón chuyên dụng cho cây ngô.
3. Cần nghiên cứu kết hợp các chủng Pseudomonas entomophila, Pseudomonas
nitroreducens, Burkholderia cenocepacia với nhau và với các chủng vi khuẩn cố định đạm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
khác có tác động tốt đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây ngô cũng là một cơ sở quan trọng để tạo ra các loại phân bón vi sinh chuyên dụng có hiệu quả cao.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Hồ Thị Kim Anh và cộng sự (1999), Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn cố định nitơ trong
rễ lúa lên sinh trưởng của mầm lúa CR203, NXB Khoa học Kỹ thuật.
2. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường, ( 1997), Thực hành hóa sinh
học, Nhà xuất bản Giáo Dục.
3. Nguyễn Thi Phương Chi và cộng sự (1999), Phối hợp các chủng Vi Khuẩn cố định Nitơ và
Vi Khuẩn hoà tan Phốt phát để nâng cao hiệu quả chế phẩm phân Vi sinh, Nhà xuất bản Khoa
học Kỹ thuật.
4. Lăng Ngọc Dậu (2004), “Khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sinh tổng hợp IAA của
Azospirillum lipoferum”, Tạp chí sinh học toàn quốc, pp 445- 448.
5. Nguyễn Anh Dũng (2010), Phân lập tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân giải phosphat
khó tan trên đất bazan nâu đỏ tại Đăk Lăk, Tạp chí công nghệ sinh học.
6. Nguyễn Anh Dũng, Trần Minh Đinh, Nguyễn Tiến Dũng (2012), “Phân lập tuyển chọn một
số chủng Azospirillum trong rễ cây ngô tại Đăk Nông” , Tạp chí công nghệ sinh học.
7. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục.
8. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đinh Xuân Mượu, Phạm Văn Ty (1977), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật (tập 3), Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật.
9. Cao Đắc Điểm, ( 1988), Cây ngô, Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội.
10. Phạm Bích Hiên, Phạm Văn Toản (2003), Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng
Azotobacter đa hoạt tính sinh học sử dụng cho sản xuất phân bón vi sinh chức năng, Báo cáo
hội nghị CNSH toàn quốc.
11. Nguyễn Hữu Hiệp, ( 2010), Bài giảng vi sinh nông nghiệp, Viện NC&PT Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ.
12. Nguyễn Hữu Hiệp, Ngô Ngọc Hưng và Nguyễn Thị Phương Tâm, ( 2006), “Phân lập và
tuyển chọn một số dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum lipoferum trên cây bắp”, Viện
Nghiên Cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ.
13. Hoàng Quốc Khánh, Nguyễn Phúc Hoàng, Ngô Đức Huy, Lê Kim Huê (1999), “Sản xuất
axit indoleacetic bởi vi khuẩn căn tầng Azospirillum brasiliense và hiệu ứng gia tăng kích thích sinh trưởng thực vật”, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật.
14. Phạm Thị Ngọc Lan (2010). Thử nghiệm tạo chế phẩm lân sinh học và đánh giá hiệu quả của chế phẩm đến một số chỉ tiêu sinh lí hóa sinh của cây lạc” Tạp chí khoa học Đại học Huế, số 63. 15. Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường (2003), Thí nghiệm hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.
16. Trần Thanh Thủy, ( 1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo dục.
17. Ngô Hữu Tình ( 1997), Giáo trình cây ngô, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
18. Phạm Văn Toản, (1999), Kết quả nghiên cứu triển khai công nghệ sản xuất phân bón vi
19. Lâm Minh Tú, Trần Văn Tuấn, (2003), Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh đơn chủng
hay đa chủng ứng dụng cho một số cây trồng, Báo cáo hội nghị CNSH toàn quốc.
20. Nguyễn Kim Vũ, Nguyễn Ngọc Quyên, Nguyễn Thu Hà, Phạm Văn Toản, Trần Tú Thuỷ (1999), Một số phương pháp lưu giữ chủng Vi sinh vật cố định Nitơ, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật.
21. Vũ Văn Vụ, ( 1999), Sinh Lý học thực vật, Nhà xuất bản Giáo Dục.
22. Ngô Thanh Phong và cộng sự, Xác định mức độ thay thế phân đạm của vi khuẩn
Pseudomonas sp TB1 và Pseudomonas sp TB2, Tạp chí khoa học 2011.
Tài liệu tiếng Anh
23. Chan Y.,W.L. Barraquio and R. Knowles. 1994 “N2-fixing Pseudomonas spp and
ralated soil bacteria”. FEMS Microbiology Reviews 13: 95-118.
24. Mirza S., M.S. Mehnaz, P. Normand, …2006. “Molecular characterization and PCR
detection of a nitrogen-fixing Pseudomonas strain promoting rice grwoth”. Biol Fertil
Soils 43:163-170.
25. Andres D. Naiman, Alejandra Latro´nico, Ine´s E. Garcı´a de Salamone ( 2009), “Inoculation of wheat with Azospirillum brasilense and Pseudomonas fluorescens: Impact
on the production and culturable rhizosphere microflora”, European Journal of Soil Biology, Vol 45, pp 44 – 51.
26. Elazar Fallik’ and Yaacov Okon (1996), “ Inoculants of Azospirillum brasilense: biomass
production, survival and growth promotion of Setaria italica and Zea mays”, Soil Biol Biochem, Vol 28, pp 123-126.
27. Fabricio Cassa´na, Diego Perriga, Vero´nica Sgroya, Oscar Masciarellia, Claudio Pennab, Virginia Lunaa (2009), “ Azospirillum brasilense Az39 and Bradyrhizobium japonicum E109,
inoculated singly or in combination, promote seed germination and early seedling growth in corn (Zea mays L.) and soybean (Glycine max L.)”, European Journal of Soil Biology, Vol 45,
pp 28 – 35.
28. Holguin G, Patten C. L, Glick B. R(1999), “ Genetics and molecular biology of
Azospirillum”, Biol Fertil Soils, pp 10 -23.
29. Abbas Akbari Gh, Seyyed Mehdi Arab, Alikhani H.A, Allahdadi I and Arzanesh M.H. (2007),
“ Isolation and Selection of Indigenous Azospirillum spp and the IAA of Superior Strains Effects on Wheat Roots”, World Journal of Agricultural Sciences, pp 523-529.
30. Martı´n Dı´az-Zorita, Marı´a Virginia Ferna´ndez-Canigia (2009), “Field performance of
a liquid formulation of Azospirillum brasilense on dryland wheat productivity”, European
Journal of Soil Biology, Vol 45, pp 3 – 11.
31. M. Fulchieri’ and L. Frion (1994), “ Azospirillum inoculation on maize (Zea Mays):effect
on yield in a field experiment in central Argentina”, Soil Biol Biochem, Vol 26, pp 921-923.
32. Puneet K.; Sohal R.P (1998). “Effect of innoculation of Azotobacter and PSN on fertilizer (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
economy, plant growth and yield of winter maize”, Nitrogen fixation with non legumes,
Kluwer Academic Publisher, pp 271-273.
33. Shabave P, Smolin Y, Strekozova I, ( 1991), “The effects of Azotobacter brasilense sp7
and Azotobacter chroococcum on nitrogen blance in soil under cropping with oats”. Biology
and Fertility of Soils, pp 290 - 292.
34. Baldani .D and Johanna Dobereiner (1979), “Host-plant specificity in the infection of
cereals with Azospirillum spp”, Soil Biol Biochem, Vol 26, pp 433- 439.
35.Bashan Y, Holgui G(1997), “Azospirillum - plat relationships: environmental and
36. Yoshida S & Forno D, (1976), “Laboratory manual for physiological studies of rice”. Philippin: IRRI., pp. 43–45.
37. Sandhya V ,Venkateswarlu B, Reddy G & Grover M "Effect of osmotic stress on plant
growth promoting Pseudomonas spp", Accepted: 30 July 2010 / Published online: 11 August
2010, Springer-Verlag 2010.
38.Caressa Hanson, “Root colonization and environmental fate of the bioherbicide
Pseudomonas fluorescens BRG100”. A thesis submitted to the College of Graduate Studies
and Research in partial fulfillment, September 2008. All rights reserved.
39. Shahbaz- Mohammadi H, Omidinia E, et at 2011, "Screening and characterization of
proline dehydrogenase flavoenzyme producing Pseudomonas entomophil",Vol 3 Number 4
PHỤ LỤC
BẢNG 1 VỊ TRÍ VÀ ĐỊA ĐIỂM THU MẪU
STT Dòng Vị trí lấy mẫu
Nền đất Địa điểm thu mẫu
1 C1 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
Xã Ea Tóh – Huyện Krông
Năng 2 C2 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
3 C3 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
4 C4 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
5 C5 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
6 C6 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
7 C7 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
8 C8 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
9 C9 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
10 C10 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
11 C11 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
12 C12 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
13 C13 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
14 C14 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
15 C15 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
16 C16 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
17 C17 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
18 C18 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
19 C19 Rễ Đất nâu đỏ trên đá macma
20 C20 Rễ Đất vàng nhạt trên đá cát 21 C21 Rễ Đất vàng nhạt trên đá cát 22 C22 Rễ Đất vàng nhạt trên đá cát 23 C23 Rễ Đất vàng nhạt trên đá cát 24 C24 Rễ Đất vàng nhạt trên đá cát 25 C25 Rễ Đất vàng nhạt trên đá cát 26 C26 Rễ Đất vàng nhạt trên đá cát 27 C27 Rễ Đất xám bạc màu 28 C28 Rễ Đất xám bạc màu 29 C29 Rễ Đất xám bạc màu 30 C30 Rễ Đất xám bạc màu 31 C31 Rễ Đất xám bạc màu
BẢNG 2: KẾT QUẢ KHẢ NĂNG SINH IAA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH N NỘI SINH PHÂN LẬP ĐƯỢC.
STT Chủng vi
khuẩn Lần 1 Hàm lượng IAA (mg/l)Lần 2 Lần 3
1 C1 5,762 5,851 6,673 2 C2 4,638 4,764 5,071 3 C3 3,146 3,925 3,761 4 C4 3,578 3,624 3,927 5 C5 5,694 5,728 5,493 6 C6 10,913 10,862 10,174 7 C7 2,198 2,126 1,987 8 C8 6,543 6,831 6,954 9 C9 8,609 8,941 8,723 10 C10 9,106 8,742 8,514
11 C11 9,321 9,463 9,307 12 C12 6,839 6,756 6,918 13 C13 9,587 9,465 9,448 14 C14 15,369 15,475 15,695 15 C15 1,849 1,895 2,458 16 C16 11,872 10,907 11,768 17 C17 7,319 7,849 6,890 18 C18 2,847 2,534 2,564 19 C19 5,824 5,523 5,086 20 C20 2,336 2,431 2,016 21 C21 6,245 5,839 6,624 22 C22 7,603 8,164 8,629 23 C23 1,753 1,845 10,647 24 C24 1,659 1,716 1,861 25 C25 6,483 6,594 6,612 26 C26 4,136 4,092 4,185 27 C27 3,062 2,948 3,267 28 C28 10,468 10,117 1,714 29 C29 7,851 7,753 7,860 30 C30 2,006 2,148 2,056 31 C31 10,569 10,738 10,865 BẢNG 3: SỐ LÁ VÀ CHIỀU DÀI LÁ. ST
T Nghiệm thức Lần 1 số láLần 2 Lần 3 Lần 1Chiều dài láLần 2 Lần 3
1 Đối Chứng 4 5 6 39,03 40,33 34,23 2 C1 7 6 7 44,81 40,57 48,99 3 C2 5 5 6 39,91 35,89 44,93 4 C3 6 5 6 48,26 50,43 46,30 5 C4 5 6 6 38,41 39,37 37,46 6 C5 7 7 8 41,20 48,35 55,29 7 C6 9 8 6 53,30 49,29 45,43 8 C7 6 9 8 47,42 50,29 44,30 9 C8 5 7 6 56,34 54,66 57,00 10 C9 7 7 6 45,15 43,05 47,10 11 C10 9 8 7 48,46 47,94 50,48 12 C11 5 6 4 60,43 58,49 62,46 13 C12 4 7 6 47,32 49,74 45,50 14 C13 7 8 7 63,40 60,50 66,45 15 C14 9 8 8 54,80 56,75 53,00 16 C15 7 6 7 52,71 50,41 55,02 17 C16 6 7 7 60,11 61,18 59,10 18 C17 7 7 6 46,32 48,28 44,34 19 C18 7 7 7 50,36 54,21 58,27 20 C19 7 7 8 38,65 39,65 40,65 21 C20 6 8 7 52,12 51,10 50,14 22 C21 8 5 7 59,41 60,31 61,51 23 C22 7 5 6 47,42 46,38 45,40 24 C23 7 8 7 67,45 60,51 61,48 25 C24 7 6 4 39,29 44,25 34,27 26 C25 7 9 6 45,95 42,05 44,00
27 C26 8 7 7 41,50 42,56 43,53 28 C27 6 7 7 40,42 39,42 41,42 29 C28 5 8 7 51,56 54,52 48,51 30 C29 5 5 7 59,73 60,76 61,82 31 C30 7 7 6 62,52 59,62 56,60 32 C31 8 9 8 75,53 70,57 65,55 THỐNG KÊ SỐ LƯỢNG LÁ Title: sola Function: FACTOR
Experiment Model Number 7:
One Factor Randomized Complete Block Design Data case no. 1 to 96.
Factorial ANOVA for the factors:
Replication (Var 1: LLL) with values from 1 to 3 Factor A (Var 2: NTHUC) with values from 1 to 32 Variable 3: SOLA
Grand Mean = 6.677 Grand Sum = 641.000 Total Count = 96 T A B L E O F M E A N S 1 2 3 Total --- 1 * 6.563 210.000 2 * 6.906 221.000 3 * 6.563 210.000 --- * 1 5.000 15.000 * 2 6.667 20.000 * 3 5.333 16.000 * 4 5.667 17.000 * 5 5.667 17.000 * 6 7.333 22.000 * 7 7.667 23.000 * 8 7.667 23.000 * 9 6.000 18.000 * 10 6.667 20.000 * 11 8.000 24.000 * 12 5.000 15.000 * 13 5.667 17.000 * 14 7.333 22.000 * 15 8.333 25.000