• Thử định tính
Cao các phân đoạn được hòa tan với từng loại dung môi thích họp với từng phản ứng định tính: thử định tính flavonoid, thử định tính với tannin và với alkanoid ... [14], [21].
Các phản ứng định tính đó được trình bày trong bảng dưới đây:
Bảng 2.2. Các phản ứng định tính đặc trưng
Nhóm họp chất
Phản ứng Thuôc thử
Mg/HCl Màu đỏ, hông, da cam xuât hiện chứng tỏ sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn xuất hydro của chúng.
Diazo hoá Diazo
Phản ứng cho màu da cam là dương tính. Dung dịch kiềm NaOH 10 %
Phản ứng có kêt quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam.
Acid sulfuric
H2so4
10
%
Phản ứng cho mâu vàng đậm cho thây sự có mặt của fayon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
Vanilin/HCl Màu đỏ son xuât hiện chứng tỏ sự có mặt của catechin.
Tannin Vanilin/H2S 04
Phản ứng dương tính nêu xuât hiện màu đỏ đậm.
Dung dịch 5% Gelatin/ 1 % NaCl
Phản ứng dương tính nêu xuât hiện kêt tủa.
Acetate chì 10% Phản ứng dương tính nêu kêt tủa xuât hiện.
Alkaloid Bouchard
at Hôn họp
KI + h
/HC1
Phản ứng dương tính nếu có màu đỏ thẫm.
VansMay
er Hôn
hợp HgCl2+
Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
Dragendorf Phản ứng dương tính nêu có kêt tủa màu da cam. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phản ứng dương tính nêu xuât hiện vòng đỏ nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng.
Polyphen ol
khác
Dung dịch kiềm Phản ứng dương tính nêu xuât hiện màu vàng.
FeCl3/HCl Phản ứng dương tính nêu xuât hiện màu lục, xanh, đen.
• Sử dụng sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp hiệu quả để phân tách nhiều hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc phân tách dựa trên sự phân bố của chúng giữa hai pha là pha động và pha tĩnh. Pha động có thể là chất lỏng hay khí, pha tính có thể là chất lỏng hay rắn. Mẩu phân tích chứa chất có ái lực khác nhau giữa pha động và pha tĩnh. Nếu chất có ái lực lớn với pha tĩnh thì nó di chuyển chậm ữong pha tĩnh, ngược lại chất có ái lực thấp trong pha tĩnh thì di chuyển nhanh hơn. Khả năng hòa tan trong pha động càng lớn thì chất càng di chuyển nhanh hơn do chuyển động của pha động [13], [16].
Chúng tôi tiến hành sắc ký trên bản mỏng sillicagen Merckn Alufolien 60 F254 hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10%. Hệ dung môi chạy sắc ký TEAF: 5:2:2:1 (Toluen - Ethylaxetac - Aceton - Fomic axid).
Xác định hệ số Rf theo công thức: Rf = a/b
Trong đó: a là khoảng di chuyển của chất nghiên cứu b là khoảng di chuyển của dung môi
* Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin - Ciocalteau Nguyên tắc: dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong
mẫu) với thuốc thử Folin - Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ ƯV VIS 1000 ở bước sóng X = 765nm, dùng chất chuẩn là
gallic axid.
Các bước tiến hành như sau:
* Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất
Dung dịch gallic axid: 0,5g gallic + lOml C2H5OH + 90ml H20 bảo quản lạnh. Như vậy dịch chuẩn gốc gallic axid có nồng độ 5mg/ml.
Dung dịch Na2C03: 200g Na2C03 + 800ml H20 đun sôi. Thêm một vài tinh thể Na2C03, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới lOOOml.
Dung dịch mẫu cần định lượng.
* Tiến hành xây dựng đường chuẩn gallic axid
Chuẩn bị cóng định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0,1, 2, 3, 5 và lOml sau đó dẫn nước cất tới lOOml ta thu được các nồng độ 0, 50,
100, 150, 250 và 500 mg/1 gallic axid.
Cho vào mỗi cuvert 20|il mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn) + l,58ml H20 + 100|il thuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300(0.1 Na2C03. Để hỗn họp dung dịch phản
ứng trong 2 giờ ở 20°c rồi xác định ở bước sóng 765mn. Tiến hành định lượng
gallic axid để dựng đường chuẩn.
* Định lượng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20(0.1 (0.02ml) để định lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn gallic axid [12], [17].