3.4.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Thí nghiệm 3: Phát hiện gen kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu bằng kỹ thuật PCR của dòng đậu tương VX93 chuyển gen ở các thế hệ T1, T2, T3.
Lựa chọn các dòng đậu tương VX93 chuyển gen sống sau khi phun thuốc Basta nồng độ 0.3%. Tiến hành thu lá để phục vụ cho tách chiết DNA kiểm tra. DNA tổng sốđược tách chiết theo phương pháp Saghai maroof [27] có một vài thay đổi để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm.
- Bước 1: Nghiền 0,3 - 0,5 gam lá đậu tương trong nitơ lỏng thành bột mịn. - Bước 2: Chuyển bột lá vào ống ly tâm 2 ml. Có sẵn 1ml đệm CTAB đã ủ ở 650C trong 10 phút bổ sung 0,1% β-Mecaptol.
- Bước 3: Ủ các ống ly tâm ở 650C trong trong 90 phút, trong quá trình ủ tiến hành đảo trộn (cứ 10 - 15phút đảo trộn 1 lần) để việc tách có hiệu quả.
- Bước 4: Ly tâm 12000 vòng/phút, trong 15 phút ở 40C. Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung 0,8 ml dung dịch 24:1, đảo trộn nhẹ nhàng trong 5 phút rồi tiến hành ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 10000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (lặp lại bước này 2 - 4 lần).
- Bước 5: Hút lớp dịch nổi sang ống mới bổ sung Isopropanol với tỷ lệ 1:1 với mẫu, bổ sung thêm 3 - 5 µl NaCl 5M. Đảo nhẹ trong 10 phút. Để trong tủ -200C qua đêm (hoặc 2 giờ).
- Bước 6: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút thu kết tủa.
- Bước 7: Rửa tủa với Ethanol 70% sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút (lặp lại 2 lần và không được đảo trộn nếu cặn đã long, đảo trộn nhẹ nhàng 1 - 2 lần khi cặn bám chắc).
Hút bỏ cồn (nếu trong trường hợp còn cồn ở cặn tủa tiến hành ly tâm 3000 vòng bằng máy ly tâm nhỏ trong 1 phút rồi hút bỏ hết phần cồn còn lại)
- Bước 8: Loại bỏ dịch lỏng để khô tự nhiên trong 30 phút.
- Bước 9: Bổ sung 30µl TE sau đó ủở 800C trong 10 phút. Đem cất giữở -200C. - Bước 10: Tiến hành điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra.
3.4.2.2. Phương pháp phân tích PCR xác định sự có mặt của gen kháng thuốc diệt cỏ (bar) và gen kháng sâu (cry1Ac) với cặp mồi đặc hiệu
Bảng 3.2. Trình tự hai cặp mồi khuếch đại vùng gen bar và gen cry1Ac
Gen Tên mồi Trình tự nucleotide (5’→3’) Kích thước sản phẩm PCR (bp)
Bar
Bar - F TCC GTA CCG AGC CGC AGG AA
408
Bar - R CCG GCA GGC TGA AGT CCA GC
cry1Ac
Cry1Ac - F TCC GTA CCG AGC CGC AGG AA
504
Hai cặp mồi sử dụng khuếch đại vùng gen bar và cry1Ac đặc hiệu được đặt sản xuất bởi hãng COSMO Genetech (Hàn Quốc). Trình tự cặp mồi được trình bày trên bảng 3.2 - Phản ứng PCR được thực hiện với các thành phần phản ứng như sau: 10x PCR Buffer : 2,5 µl MgCl2 (25 mM) : 1,5 µl dNTPs (2,5 mM) : 2,0 µl Mồi xuôi (F (10 µM) : 1,0 µl Mồi ngược (R (10 µM) : 1,0 µl
Taq DNA polymerase (5U/µl) : 0,2 µl
DNA khuôn : 2,5 µl
H2O khử ion : 14,3 µl
- Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gen bar bao gồm:
Biến tính ban đầu ở 95oC : 5 phút
Biến tính ở 95oC : 30 giây
35 chu kỳ
Gắn mồi ở 55oC : 30 giây
Kéo dài mồi ở 72oC : 30 giây
Kéo dài cuối cùng ở 72oC : 2 phút
Ủ bảo quản mẫu ở 4oC : ∞
- Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gen cry1Ac bao gồm:
Biến tính ban đầu ở 95oC : 5 phút
Biến tính ở 95oC : 30 giây
35 chu kỳ
Gắn mồi ở 55oC : 30 giây
Kéo dài mồi ở 72oC : 45 giây
Kéo dài cuối cùng ở 72oC : 2 phút
Ủ bảo quản mẫu ở 4oC : ∞
3.4.2.3. Phương pháp điện di sản phẩm DNA tổng số và PCR sản phẩm Agarose 0,8% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50- 600C.
Đổ dung dịch vào khay gel đó cài sẵn răng lược thích hợp. Sau 30-60 phút, khi gel đó đông, tháo răng lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel một khoảng 2mm.
Mẫu DNA trộn cùng với Loadingdye theo tỷ lệ thích hợp, tra mẫu vào các giếng trên bản gel.
Tiến hành điện di trên máy máy điện di Mupid - plus với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện vào khoảng 60-80 mA. Theo dõi sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để ngừng vào thời gian phù hợp (thường sau khoảng 20 phút).
Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi gel WUV - L50, DNA được hiện lên dưới dạng các vạch sáng, ảnh điện được di được chụp ảnh gel.
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN