và gen cry1Ac
2.5.1. Trên thế giới
Bên cạnh việc tạo cây trồng chuyển gen thì công tác nghiên cứu, đánh giá, theo dõi khả năng tồn tại và biểu hiện của gen chuyển là vô cùng quan trọng và không thể tách rời.
Năm 1994, Paz M. và cs [29] thực hiện thí nghiệm chuyển gen Bt vào cây đậu tương. Tác giả sử dụng gen cry1Ac được phân lập từ chủng Bacillus thuringiensis var. Kurstaki để tạo cây đậu tương chuyển gen Bt đầu tiên. Các cây chuyển gen Bt
này khi được dùng làm thức ăn cho sâu ăn lá Velvetbean (Anticarsia gemmatalis),
làm sâu biếng ăn, chậm phát triển và tỷ lệ sống sót giảm, kết quả biểu hiện tính kháng tương đương với giống đậu tương chuẩn kháng CatIR81 - 296 có tính kháng cao đối với sâu bộ cánh vảy. Độđộc không cao của các cây đậu tương chuyển gen
Bt này được xác định là do mức biểu hiện thấp của Bt protein (ít hơn 1ng Bt
protein/mg protein tổng số) trong cây đậu tương.
Năm 2009, Tindall KV và cs [34] đã theo dõi sự biểu hiện của gen cry1Ac
được chuyển vào cây đậu tương và củ cải, kết quả nghiên cứu cho thấy ấu trùng gây hại bị chếtvơi tỷ lệ rất lớn (90 - 100%) khi ăn phải protein do gen chuyển mã hóa.
Ngoài ra, Stewart C.N.Jr. và cs (1996) [31] đã sử dụng phôi vô tính của giống cải dầu để chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium thuringiensis được điều khiển bằng promoter 35s và liên kết với gen HPH, có 3 dòng chuyển gen trên môi trường chọn lọc qua có chứa hygromycin và được chuyển vào thực vật. Hiệu quả của việc chuyển gen được đánh giá nhờ phương pháp PCR cho kết quả dòng khôi phục có chứa gen HPH nhưng gen Bt bị mất ở một dòng. Plasmid được sắp xếp lại ở dòng thứ 2, và dòng thứ 3 có cả 2 gen, một trong sốđó đã được khôi phục.
Gen mã hóa enzyme tổng hợp 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimic (EPSPS), gen
mã hóa enzyme phosphinothricin acetyl transerase (PAT) đã được chuyển vào cây
đậu tương và tạo ra các dòng đậu tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ glyphosate/glufosinate [33]. Các giống đậu tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ glufosinate, Roundup và imidazoline đã được thương mại hóa.
Monsanto, công ty giữ bản quyền về giống đậu tương chuyển gen kháng cỏ “Round up” thống kê cho thấy năm 1996 có khoảng 0,4 triệu hecta trồng đậu tương kháng thuốc diệt cỏ, năm 1997 tăng lên 3,6 triệu hecta, năm 1998 đạt 11,3 triệu hecta đến năm 2007 đạt 12 triệu ha chiếm 10% cây trồng chuyển gen [33], [35]. Theo thống kê của USDA, diện tích trồng cây đậu tương kháng thuốc diệt cỏ chiếm 81% ở Mỹ, 99,1% ở Argentina và 34% ở Brazil [9].
Việc phát triển công nghệ chuyển gen một cách hiệu quả vào đậu tương cần tạo điều kiện cho việc tạo ra hạt giống chuyển gen cho năng suất cao, chất lượng tốt. Kết quả chuyển gen cần phải được đánh giá bằng nhiều phương pháp khác nhau
như PCR, Southern Blot, Northern Blot,... Trong đó phương pháp PCR và Southern
Blot đang được nhiều nhà khoa học quan tâm và sử dụng trong việc đánh giá hiệu quả chuyển gen.
Xing A. và cs (2000) [37] chuyển vector pPTN133 chứa gen gus và gen bar
vào đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium thuringiensis. Các tác giả đã phân tích sự có mặt của 2 gen mà trong các dòng đậu tương chuyển gen qua các thế hệ bằng kỹ thuật Southern Blot và PCR, đã chứng minh được sự di truyền độc lập của
gen gus và gen bar.
2.5.2. Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, các phương pháp sinh học phân tử cũng đã được ứng dụng rộng rãi trong việc đánh giá hiệu quả chuyển gen.
Trần Thị Cúc Hòa và cs (2008) [8] đã sử dụng phương pháp phân tích Southern Blot đánh giá hiệu quả việc biến nạp vào nốt lá mầm thông qua
A.tumefaciens mang vector nhị thể pZY102/pTF102 chứa gen bar, gen gus A và gen
kháng glufosinate ở giống đậu tương PC19. Qua các cây T0 cho thấy hiệu quả chuyển nạp gen là 1 - 3%.
Trong đề tài nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens, Nguyễn Tiến Dũng (2010) [5] đã sử dụng phương pháp PCR đểđánh giá hiệu quả chuyển gen. Qua phân tích bằng PCR, xác định sự có mặt của gen gfp trong các dòng đậu tương sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn gen có kích thước 600bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, trong tổng số 13 dòng được kiểm tra có 6 dòng xuất hiện băng điện di có kích thước phù hợp.
Ngoài ra, Đinh Thị Ngọc và cs (2008) [10] cũng đã sử dụng phương pháp PCR để đánh giá hiệu quả nhân gen chaperonin tế bào chết ở các giống đậu tương. Kết quả cho thấy, cả 5 giống đậu tương đều thu được sản phẩm PCR với kích thướng phân tử là 1,6 kb. Kích thước sản phẩm PCR nhận được chính bằng kích thước phân tử của cDNA gen chaperonin giống đậu tương Bonminori - Nhật Bản. Điều này chứng tỏ cả 5 giống đậu tương nghiên cứu đều có gen chaperonin và không có
intron trong cấu trúc gen. Lượng DNA được nhân lên qua phản ứng PCR đủđể thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
PHẦN 3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU