a. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol toàn phần hai loài trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro
Chuẩn bị nước tiểu nhân tạo, dung dịch acid oxalic và chứng dương natri citrat như mô tả phần 2.3.3.2; dung dịch mẫu thử như mô tả ở mục 2.3.3.1. Bố trí
đánh giá tác dụng của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol hai loài ở 4 độ pha loãng 1/2, 1/4, 1/8, 1/16. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần với 10 lô (mỗi lô tiến hành thử trên 8 giếng), thành phần mỗi giếng tương ứng mỗi lô như sau :
- 1 lô trắng sỏi: 160 µl nước tiểu nhân tạo + 20 µl nước + 20 µl dung dịch acid oxalic.
- 1 lô chứng dương: 160 µl nước tiểu nhân tạo + 20 µl dung dịch natri citrat 150 mM + 20 µl dung dịch acid oxalic.
- 4 lô trắng mẫu thử: 160 µl nước tiểu nhân tạo + 20 µl nước + 20 µl dung dịch mẫu thử (mẫu thử là dịch chiết dược liệu (nước/ethanol) ở các độ pha loãng 1/2, 1/4, 1/8, 1/16).
- 4 lô thử: 160 µl nước tiểu nhân tạo + 20 µl dung dịch mẫu thử + 20 µl dung dịch acid oxalic (mẫu thử là dịch chiết dược liệu (nước/ethanol) ở các độ pha loãng 1/2, 1/4, 1/8, 1/16)
Xác định mật độ quang OD620 nm ở bước sóng 620nm tại thời điểm 5 phút sau khi thêm acid oxalic vào hỗn hợp phản ứng trong giếng để tạo sỏi.
Chụp ảnh tinh thể: sau khi kết thúc thí nghiệm, tinh thể trong các giếng được quan sát bằng kính hiển vi soi ngược ở vật kính 40x. Mỗi lô trong thí nghiệm được quan sát ở 8 vi trường trên 8 giếng, sau đó vi trường đại diện cho mỗi lô được chụp lại bằng máy ảnh Canon kết nối trực tiếp với kính hiển vi.
b. Đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro
Khảo sát ảnh hưởng của dung môi ethanol trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro.
Để đánh giá tác dụng của cắn các phân đoạn trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro, cần phải khảo sát ảnh hưởng của dung môi pha cắn dến sự hình thành sỏi để lựa chọn được nồng độ dung môi phù hợp.
Với dung môi ethanol, thí nghiệm được bố trí đánh giá ảnh hưởng của dung môi ở các nồng độ 80%, 50%, 20%, 10% và 5% (nồng độ thể tích/thể tích) trước
khi cho vào giếng song song với mẫu trắng tạo sỏi trong môi trường nước. Cách tiến hành tương tự phần a.
Đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết:
Tiến hành thí nghiệm như phần a với mẫu thử là cắn các phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70% được pha lại trong ethanol ở nồng độ thích hợp để thu được các dung dịch có nồng độ 10 µg/ml, 100 µg/ml, 1000 µg/ml. Trong lô trắng sỏi: 20 µl nước được thay bằng 20 µl ethanol có cùng nồng độ với ethanol pha cắn và lô chứng dương natri citrat cũng được hòa tan trong ethanol cùng nồng độ.
c. Đánh giá kết quả
Ảnh hưởng của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết 2 loài
Ficus religiosa L. và Ficus rumphii Blume trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro được đánh giá dựa trên các thông số:
o Giá trị phần trăm ức chế (% ức chế).
o Hình ảnh tinh thể calci oxalat quan sát được dưới kính hiển vi sau khi kết thúc thí nghiệm: số lượng, kích thước tinh thể calci oxalat tạo thành và tỷ lệ dạng COD/COM.
Phần trăm ức chế hình thành tinh thể calci oxalat của natri citrat và mẫu thử được tính theo công thức:
% ức chế = × 100
a: ODTB mẫu trắng sỏi
b: ODTB mẫu trắng dung dịch thử
c: ODTB mẫu tạo sỏi khi có mặt dung dịch thử.
(ODTB là trung bình cộng giá trị OD620nm trên 8 giếng của mỗi lô trong một thí nghiệm).
Nếu % ức chế > 0: chất thử có tác dụng ức chế quá trình hình thành tinh thể calci oxalat.
Nếu % ức chế ≤ 0: chất thử không có tác dụng ức chế quá trình hình thành tinh thể calci oxalat. Trong trường hợp này chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của chất thử lên quá trình tạo sỏi là ∆OD = c - b - a. Đây là độ đục tăng thêm do số lượng tiểu
phân tinh thể calci oxalat tăng lên khi có mặt chất thử so với mẫu trắng sỏi. Đồng thời đánh giá trên hình ảnh quan sát được dưới kính hiển vi.