Cả 2 loài Ficus religiosa L.và Ficus rumphii Blume đều được chuẩn bị dịch chiết toàn phần và các phân đoạn trong điều kiện giống nhau:
- Dịch chiết nước thu được bằng phương pháp sắc (5 gam dược liệu trong 50 ml nước, sắc 3 lần, mỗi lần 30 phút tính từ thời điểm sôi). Dịch chiết nước sau đó được cô đặc đến dạng cao lỏng 1: 1 (1 ml tương ứng với 1 g dược liệu khô). Cao lỏng 1:1 được pha loãng trong nước cất 2 lần thành các tỷ lệ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16.
- Dịch chiết ethanol toàn phần thu được bằng phương pháp chiết hồi lưu với ethanol 70% (50 gam dược liệu trong 350 ml ethanol 70%, chiết hồi lưu 3 lần, lần đầu tiên trong 1 giờ, 2 lần sau mỗi lần 30 phút tính từ thời điểm sôi). Bay hơi dung môi đến khi thể tích còn lại 50 ml (1 ml tương ứng với 1 gam dược liệu khô). Dịch chiết 1:1 này được lọc và pha loãng trong nước cất 2 lần thành các tỷ lệ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16.
- Chiết xuất các phân đoạn từ dịch chiết ethanol toàn phần bằng phương pháp chiết lỏng- lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan, dicloromethan và ethyl acetat. Các phân đoạn này được bay hơi hết dung môi hữu cơ thu được cắn các phân đoạn tương ứng. Phần nước còn lại sau khi lắc với dung môi hữu cơ được cô đặc đến cắn.
2.3.3.2 Chuẩn bị nước tiểu nhân tạo, dung dịch acid oxalic và dung dịch natri citrat (chứng dương)
Chuẩn bị dung dịch nước tiểu nhân tạo:
Dung dịch nước tiểu nhân tạo được pha theo công thức của Kavanagh và cộng sự (1990) [43] và có điều chỉnh để phù hợp với mô hình trên bản nhọn 96 giếng như sau:
Bảng 2.1 Thành phần nước tiểu nhân tạo theo Kavanagh và cộng sự [43]
NaCl 368,0 NH4Cl 8,05
KCl 188,825 MgCl2 7,5
Na2HPO4 57,5 Natri citrat 5,0
(NH4)2HPO4 50,375 CaCl2 15,0
Đơn vị: mmol/l
Dung môi sử dụng là nước cất 2 lần được lọc qua máy lọc RO, làm ấm đến 370C, hòa tan lần lượt các thành phần trên và điều chỉnh pH bằng dung dịch HCl 1N đến pH 6,0 ± 0,1; sau đó để ổn định ở 370
C. Chuẩn bị dung dịch acid oxalic:
Dung dịch acid oxalic pha ở nồng độ 0,04N; để ổn định ở 370
C. Chuẩn bị dung dịch chứng dương natri citrat:
Dung dịch natri citrat pha ở nồng độ 150 mM; để ổn định ở 370
C.
2.3.3.3 Bố trí thí nghiệm và đánh giá kết quả
a. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol toàn phần hai loài trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro
Chuẩn bị nước tiểu nhân tạo, dung dịch acid oxalic và chứng dương natri citrat như mô tả phần 2.3.3.2; dung dịch mẫu thử như mô tả ở mục 2.3.3.1. Bố trí
đánh giá tác dụng của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol hai loài ở 4 độ pha loãng 1/2, 1/4, 1/8, 1/16. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần với 10 lô (mỗi lô tiến hành thử trên 8 giếng), thành phần mỗi giếng tương ứng mỗi lô như sau :
- 1 lô trắng sỏi: 160 µl nước tiểu nhân tạo + 20 µl nước + 20 µl dung dịch acid oxalic.
- 1 lô chứng dương: 160 µl nước tiểu nhân tạo + 20 µl dung dịch natri citrat 150 mM + 20 µl dung dịch acid oxalic.
- 4 lô trắng mẫu thử: 160 µl nước tiểu nhân tạo + 20 µl nước + 20 µl dung dịch mẫu thử (mẫu thử là dịch chiết dược liệu (nước/ethanol) ở các độ pha loãng 1/2, 1/4, 1/8, 1/16).
- 4 lô thử: 160 µl nước tiểu nhân tạo + 20 µl dung dịch mẫu thử + 20 µl dung dịch acid oxalic (mẫu thử là dịch chiết dược liệu (nước/ethanol) ở các độ pha loãng 1/2, 1/4, 1/8, 1/16)
Xác định mật độ quang OD620 nm ở bước sóng 620nm tại thời điểm 5 phút sau khi thêm acid oxalic vào hỗn hợp phản ứng trong giếng để tạo sỏi.
Chụp ảnh tinh thể: sau khi kết thúc thí nghiệm, tinh thể trong các giếng được quan sát bằng kính hiển vi soi ngược ở vật kính 40x. Mỗi lô trong thí nghiệm được quan sát ở 8 vi trường trên 8 giếng, sau đó vi trường đại diện cho mỗi lô được chụp lại bằng máy ảnh Canon kết nối trực tiếp với kính hiển vi.
b. Đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro
Khảo sát ảnh hưởng của dung môi ethanol trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro.
Để đánh giá tác dụng của cắn các phân đoạn trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro, cần phải khảo sát ảnh hưởng của dung môi pha cắn dến sự hình thành sỏi để lựa chọn được nồng độ dung môi phù hợp.
Với dung môi ethanol, thí nghiệm được bố trí đánh giá ảnh hưởng của dung môi ở các nồng độ 80%, 50%, 20%, 10% và 5% (nồng độ thể tích/thể tích) trước
khi cho vào giếng song song với mẫu trắng tạo sỏi trong môi trường nước. Cách tiến hành tương tự phần a.
Đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết:
Tiến hành thí nghiệm như phần a với mẫu thử là cắn các phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70% được pha lại trong ethanol ở nồng độ thích hợp để thu được các dung dịch có nồng độ 10 µg/ml, 100 µg/ml, 1000 µg/ml. Trong lô trắng sỏi: 20 µl nước được thay bằng 20 µl ethanol có cùng nồng độ với ethanol pha cắn và lô chứng dương natri citrat cũng được hòa tan trong ethanol cùng nồng độ.
c. Đánh giá kết quả
Ảnh hưởng của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết 2 loài
Ficus religiosa L. và Ficus rumphii Blume trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro được đánh giá dựa trên các thông số:
o Giá trị phần trăm ức chế (% ức chế).
o Hình ảnh tinh thể calci oxalat quan sát được dưới kính hiển vi sau khi kết thúc thí nghiệm: số lượng, kích thước tinh thể calci oxalat tạo thành và tỷ lệ dạng COD/COM.
Phần trăm ức chế hình thành tinh thể calci oxalat của natri citrat và mẫu thử được tính theo công thức:
% ức chế = × 100
a: ODTB mẫu trắng sỏi
b: ODTB mẫu trắng dung dịch thử
c: ODTB mẫu tạo sỏi khi có mặt dung dịch thử.
(ODTB là trung bình cộng giá trị OD620nm trên 8 giếng của mỗi lô trong một thí nghiệm).
Nếu % ức chế > 0: chất thử có tác dụng ức chế quá trình hình thành tinh thể calci oxalat.
Nếu % ức chế ≤ 0: chất thử không có tác dụng ức chế quá trình hình thành tinh thể calci oxalat. Trong trường hợp này chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của chất thử lên quá trình tạo sỏi là ∆OD = c - b - a. Đây là độ đục tăng thêm do số lượng tiểu
phân tinh thể calci oxalat tăng lên khi có mặt chất thử so với mẫu trắng sỏi. Đồng thời đánh giá trên hình ảnh quan sát được dưới kính hiển vi.
2.3.3.4 Xử lý số liệu
Số liệu được lưu trữ và xử lý bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007. Mẫu được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Sử dụng kiểm định ANOVA với phân tích hậu kiểm (post- hoc) Dunnette để so sánh sự khác biệt và giá trị trung bình giữa các lô. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Đặc điểm vi học lá 2 loài Ficus religiosa L. và Ficus rumphii Blume. 3.1.1 Đặc điểm vi phẫu lá
3.1.1.1 Loài Ficus religiosa L.
Vi phẫu lá xem hình 3.1
Phần gân chính: Gân lá lồi đều ở cả hai mặt trên và dưới. Từ ngoài vào trong có: Biểu bì trên (1) và biểu bì dưới (2) là một hàng tế bào tròn nhỏ, xếp đều đặn. Mô dày (3) gồm 3- 4 lớp tế bào xếp sát biểu bì trên và dưới, kích thước lớn hơn tế bào biểu bì, tế bào tròn, thành dày khá đều nhau. Phía trong mô dày là mô mềm vỏ (9) cấu tạo từ những tế bào thành mỏng, kích thước lớn, rải rác có các tinh thể calci oxalat hình khối. Mô cứng (4) là những tế bào nhỏ đều đặn, thành dày hóa gỗ tạo thành vòng cung liên tục bao quanh bó libe- gỗ. Libe cấp 2 (5) xếp liên tục thành vòng bao xung quanh gỗ cấp 2 (6). Trong cùng là mô mềm ruột, trong mô mềm ruột (7) còn có các bó libe (8) nằm riêng biệt được bao bọc bởi các vòng mô cứng (12).
Phần phiến lá: Từ ngoài vào trong có: biểu bì trên (1) và biểu bì dưới (2) giống phần gân lá, gồm một hàng tế bào tròn nhỏ, xếp đều đặn. Tiếp theo biểu bì trên có các mô khuyết hình tròn hoặc hình chữ nhật lớn (14), rải rác bên trong có các tinh thể calci carbonat (13). Mô giậu (10) gồm 1- 2 hàng tế bào hình chữ nhật xếp vuông góc với bề mặt lá. Bên trong là mô mềm (11).
3.1.1.2 Loài Ficus rumphii Blume
Vi phẫu lá xem hình 3.2
Phần gân chính: Gân lá ở mặt trên lồi ít, mặt dưới lồi nhiều. Từ ngoài vào trong có: Biểu bì trên (1) và dưới (2) là một hàng tế bào tròn nhỏ, xếp đều đặn. Xếp sát biểu bì trên là mô dày (3) tế bào tròn, thành dày, kích thước lớn hơn tế bào biều bì, trong đó 3- 4 hàng đã hóa gỗ bắt màu xanh trong phương pháp nhuộm kép. 1- 2 lớp mô mềm vỏ (9) phía trong là những tế bào tròn, to nhỏ nhiều kích thước, thành mỏng. Xếp sát biểu bì dưới là mô dày (3’) gồm 3- 4 lớp tế bào đã hóa gỗ bắt màu xanh. Mô mềm vỏ (9’) gồm 9- 10 lớp. Rải rác trong mô mềm vỏ có các tinh thể calci oxalat hình khối. Mô cứng (4) tạo thành những đám nhỏ nằm rải rác , xen kẽ
với các sợi gỗ bao xung quanh bó libe- gỗ. Libe cấp 2 (5) xếp liên tục tạo thành vòng bao xung quanh gỗ cấp 2 (6). Trong bó libe- gỗ là mô mềm ruột (7), trong mô mềm ruột còn có các bó libe (8) nằm riêng biệt.
Phần phiến lá: biểu bì trên (1) và dưới (2) giống phần gân chính. Sát với biểu bì trên là các mô khuyết (14) lớn, thành mỏng, rải rác có các tinh thể calci carbonat (13). Tiếp theo là mô giậu (10) gồm 1- 2 lớp tế bào hình chữ nhật thành mỏng xếp vuông góc với bề mặt lá. Bên trong là mô mềm (11).
Bảng 3.1 So sánh đặc điểm vi phẫu hai loài Ficus religiosa L. và Ficus rumphii Blume
Ficus religiosa L. Ficus rumphii Blume
Phần gân chính
Các bộ phận từ ngoài vào trong đều gồm: tế bào biểu bì, mô dày, mô mềm, mô cứng, libe cấp 2 bao xung quanh gỗ cấp 2, trong mô mềm ruột có các bó libe nằm riêng biệt được bao bọc bởi vòng mô cứng.
- Hình dạng: lồi đều ở mặt trên và dưới.
- Mô dày gồm 3- 4 lớp tế bào, không hóa gỗ, giống nhau ở cả mặt trên và dưới.
- Mô mềm gồm 3- 4 lớp tế bào giống nhau cả mặt trên và dưới.
- Mô cứng dày xếp thành vòng liên tục.
- Hình dạng: mặt trên lồi ít, mặt dưới lồi nhiều
- Mô dày khác nhau ở mặt trên và dưới. Mặt trên có 2- 3 lớp tế bào không hóa gỗ xếp sát với biểu bì trên rồi mới đến 3- 4 lớp tế bào mô dày hóa gỗ bắt màu xanh. Mặt dưới là 4- 5 lớp tế bào hóa gỗ.
- Mô mềm khác nhau mặt trên và dưới. Mặt trên chỉ có 1- 2 lớp tế bào. Mặt dưới dày gồm 9- 10 lớp tế bào.
- Mô cứng mỏng tạo các đám rời rạc
Phần phiến
lá
Hình 3.1 Vi phẫu lá Ficus religiosa L.
Hình 3.2 Vi phẫu lá Ficus rumphii Blume
1 3 4 5 6 9 7 12 8 2 1 2 11 10 13 1 2 3’ 4 5 6 7 8 9’ 10 11 1 2 13 14 14 3 9
3.1.2 Đặc điểm bột lá
3.1.2.1 Đặc điểm bột lá loài Ficus religiosa L. (hình 3.3)
Bột màu vàng nâu, không mùi, vị hơi chát. Soi dưới kính hiển vi thấy: rất nhiều mảnh biểu bì mang lỗ khí hình song bào rõ (1). Tế bào mô mềm (2) gồm những tế bào hình đa giác, thành mỏng, rải rác có các hạt tinh bột (11) hình tròn hoặc trứng, có rốn rõ kích thước 0,005- 0,006 mm. Nhiều tinh thể calci oxalat hình khối (10) kích thước khoảng 0,014 × 0,013 mm cũng như tinh thể calci carbonat (9) kích thước khoảng 0,049 × 0,037 mm đứng riêng rẽ. Sợi thành dày, khoang tế bào hẹp thường kết lại thành bó (6). Nhiều mảnh mạch xoắn, mạch điểm (4, 5). Rải rác có các mảnh mang màu đỏ hoặc nâu đỏ (7). Mô giậu (3) gồm các tế bào hình chữ nhật dài xếp song song. Nhiều khối nhựa màu vàng (8) có các vân đồng tâm.
3.1.2.2 Đặc điểm bột lá loài Ficus rumphii Blume (hình 3.4)
Bột màu vàng nâu, mùi thơm, vị nhạt. Quan sát dưới kính hiển vi thấy: rất nhiều mảnh biểu bì mang lỗ khí (1) hình song bào rõ. Mảnh tế bào mô mềm (2) gồm những tế bào hình đa giác, thành mỏng, rải rác có các hạt tinh bột hình tròn hoặc hình trứng (8), có rốn rõ, kích thước khoảng 0,009- 0,011 mm. Bó sợi gồm các sợi thành dày kết lại (5). Rải rác có các tinh thể calci oxalat hình khối đứng riêng rẽ, kích thước khoảng 0,021 × 0,017 mm. Tinh thể calci carbonat (7) xuất hiện khá nhiều, kích thước khoảng 0,100 × 0,046 mm đứng riêng rẽ. Rải rác có các mảnh mạch xoắn, mạch thang (4). Mô giậu (3) gồm các tế bào hình chữ nhật dài xếp song song. Nhiều mảnh mang màu đỏ hoặc nâu đỏ (6).
Hình 3.3 Một số đặc điểm bột lá loài Ficus religiosa L.
1. Mảnh biểu bì mang lỗ khí; 2. Mảnh mô mềm; 3. Mô giậu; 4, 5. Mảnh mạch; 6. Bó sợi; 7. Mảnh mang màu; 8. Khối nhựa; 9. Tinh thể calci carbonat; 10.Tinh
thể calci oxalat hình khối; 11. Tinh bột.
Hình 3.4 Một số đặc điểm bột lá loài Ficus rumphii Blume
1. Mảnh biểu bì mang lỗ khí; 2. Mảnh mô mềm; 3. Mô giậu; 4. Mảnh mạch; 5. Bó sợi; 6. Mảnh mang màu; 7. Tinh thể caclci carbonat; 8. Tinh bột; 9. Tinh thể calci
Bảng 3.2 So sánh đặc điểm bột lá hai loài Ficus religiosa L. và
Ficus rumphii Blume
Ficus religiosa L. Ficus rumphii Blume
Giống nhau
- Mảnh biểu bì mang lỗ khí hình song bào rõ
- Mô mềm tế bào thành mỏng, rải rác có tinh bột với rốn rõ - Tinh thể calci oxalat hình khối và tinh thể calci carbonat
- Bó sợi
- Đều có các mảnh mạch, mảnh mang màu.
Khác nhau
- Kích thước tinh bột: khoảng 0,005- 0,006 mm
- Hình dạng và kích thước tinh thể calci carbonat: trung bình khoảng 0,049 × 0,037 mm
- Mảnh mang màu ít
- Có nhiều khối nhựa màu vàng.
- Kích thước tinh bột: khoảng 0,009- 0,011 mm
- Hình dạng và kích thước tinh thể calci carbonat: trung bình khoảng 0,100 × 0,046 mm
- Rất nhiều mảnh mang màu - Không có.
3.2 Đánh giá tác dụng của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết hai loài Ficus religiosa L. và Ficus rumphii Blume trên sự hình thành tinh chiết hai loài Ficus religiosa L. và Ficus rumphii Blume trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro
3.2.1 Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử của hai loài Ficus religiosa L. và Ficus rumphii Blume được tiến hành theo mục 2.3.3.1.
Hình 3.5 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ dịch chiết toàn phần của hai loài
Ficus religiosa L. và Ficus rumphii Blume Lớp n-hexan
Lớp CH2Cl2
Cắn CH2Cl2 Lớp nước
Cất thu hồi dung môi dưới áp lực giảm rồi cô đặc
Lớp nước
+ CH2Cl2
Cất thu hồi dung môi dưới áp lực giảm
Cắn n-hexan + thêm nước
+ n- hexan
Cất thu hồi dung môi dưới áp lực giảm
+ EtOAc
Lớp nước
Cắn
+ Cô đặc Cất thu hồi dung môi dưới áp
lực giảm Dịch chiết đậm đặc
+ EtOH 70% ( chiết hồi lưu 3 lần, 2 giờ). Dược liệu
Dịch chiết EtOH 70% toàn phần
Cắn ethyl acetat Lớp ethyl
Hàm lượng cắn các phân đoạn thu được được tính theo công thức:
F% = ×100
Trong đó:
F là hàm lượng cắn (%) a là khối lượng cắn ( gam) M là khối lượng dược liệu (gam) h là hàm ẩm của dược liệu Hàm ẩm dược liệu:
- Loài Ficus religiosa L. được xác định là 6,69% - Loài Ficus rumphii Blume được xác định là 8, 35%
Hàm lượng cắn các phân đoạn hai loài được trình bày trong bảng 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3 Hàm lượng cắn các phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70%