3.2.1. Về phƣơng pháp bào chế
Trong rất nhiều phƣơng pháp bào chế liposome, phƣơng pháp bốc hơi pha đảo là một trong những phƣơng pháp đơn giản và cho hiệu suất cao [26]. Vì hạn chế của phƣơng pháp này là có thể tồn dƣ dung môi hữu cơ trong chế phẩm tạo thành, chúng tôi đã nghiên cứu và tham khảo nghiên cứu của Ngô Thị Bích Phƣợng [4] quyết định lựa chọn thời gian cất quay là 1,5 h để loại hết dung môi. Chúng tôi đã thử bào chế liposome RES bằng phƣơng pháp hydrat hóa màng film sử dụng dung môi ethanol. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cho hiệu suất liposome hóa không cao, chỉ khoảng 50 – 60 %, kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu bào chế liposome bằng phƣơng pháp hydrat hóa màng film [10],[11],[15].
Phƣơng pháp bào chế sử dụng trong nghiên cứu này cho hiệu suất liposome hóa cao hơn các nghiên cứu khác. So với phƣơng pháp hydrat hóa, màng film đƣợc sử dụng trong nghiên cứu của Claudia Bonechi và cộng sự cho hiệu suất liposome hóa khoảng 50 % [11], hay nghiên cứu của Bojana D. Isailovi´c và cộng sự chỉ cho hiệu suất tải thuốc dƣới 50 % (44,2 %) [10]. Phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu này cho hiệu suất cao hơn hẳn, từ 80 đến 90%, mẫu cao nhất cho hiệu suất 95.66% (bảng 7), ngoài ra, cả KTTP và PDI của liposome tạo ra trong nghiên cứu cũng thấp hơn đáng kể so với nghiên cứu của Claudia Bonechi và cộng sự (250 nm so với 350 nm)[11].
Nếu so sánh với nghiên cứu của Xin Y. L. và cộng sự [26], sử dụng cùng phƣơng pháp bào chế cũng nhƣ phƣơng pháp làm nhỏ KTTP, thì nghiên cứu này cho hiệu suất cao hơn, tuy nhiên, KTTP và PDI là lớn hơn (hiệu suất 95,66% so với 95%) (KTTP khoảng 250 nm và PDI khoảng 0.4 so với 100 nm, PDI < 0,2). Có thể do khi tiến hành chúng tôi đã cải tiến quy trình, không cất quay 20 phút nhƣ trong nghiên cứu của Xin Y. L. và cộng sự [26], mà
chúng tôi tiến hành cất quay thêm 1 h sau khi ether bay hơi hết, vì theo
Cortesi R. ether tồn dƣ trong chế phẩm có thể gây rò rỉ dƣợc chất, ngoài ra chúng tôi còn tiến hành làm lạnh mẫu bằng nƣớc đá khi siêu âm để tránh hiện tƣợng quá nhiệt gây oxy hóa RES [16]
Về phƣơng pháp làm nhỏ KTTP, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp siêu âm trong nghiên cứu, bởi phƣơng pháp này đơn giản, thời gian tiến hành nhanh và không cần thiết bị quá phức tạp. Tuy nhiên, liposome thu đƣợc có kích thƣớc tiểu phân khá lớn, phân bố KTTP chƣa đồng nhất (bảng 6, 7), cũng nhƣ nghiên cứu chỉ mới tiến hành siêu âm trong thời gian 5 phút mà chƣa khảo sát đƣợc thời gian siêu âm khác nhau. Do vậy, cần có thêm các nghiên cứu tiếp theo khảo sát ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến KTTP, PDI và hiệu suất liposome hóa cũng nhƣ so sánh phƣơng pháp siêu âm với các phƣơng pháp làm nhỏ kích thƣớc tiểu phân khác nhƣ phƣơng pháp đẩy qua màng.
3.2.2. Về phƣơng pháp định lƣợng RES
Hiện nay trên thế giới cũng nhƣ trong nƣớc đã áp dụng rộng rãi các phƣơng pháp định lƣợng RES hiện đại, cho độ chính xác cao nhƣ: HPLC, LC-MS [2], [5], [12]. Phƣơng pháp định lƣợng bằng đo độ hấp thụ quang khá cổ điển và ít đƣợc áp dụng. Tuy nhiên, ƣu điểm của phƣơng pháp này là đơn giản, cho kết quả nhanh Theo Camont L. và cộng sự, định lƣợng RES bằng phƣơng pháp đo quang cho kết quả khác biệt không đáng kể so với dùng HPLC [14]. Do vậy, chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp đo quang để định lƣợng RES.
Để định lƣợng RES đƣợc tải trong liposome, chúng tôi tiến hành phá màng bằng Triton X-100 1 %, sau đó pha loãng để đo quang. Vì phổ hấp thụ của RES trong các môi trƣờng khác nhau là khác nhau, chúng tôi tiến hành quét lại phổ hấp thụ của RES trong môi trƣờng Triton 1 % và đệm PBS pH 7,4, cho thấy λmax của RES trong môi trƣờng này là 308,5 nm (trong nƣớc là 304 nm) [41].
3.2.3. Ảnh hƣởng của các yếu tố công thức và quy trình bào chế tới tính chất hệ liposome tạo thành tính chất hệ liposome tạo thành
3.2.3.1. Ảnh hƣởng của công thức bào chế
PL là thành phần cơ bản cấu tạo liposome, chol đƣợc thêm vào đóng vai trò ổn định màng. Các nghiên cứu trƣớc đây đã sử dụng các phƣơng pháp bào chế khác nhau với tỉ lệ RES/SPC/chol khác nhau. Thông thƣờng, sử dụng tỉ lệ khối lƣợng RES/SPC = 1/20 (tƣơng ứng tỉ lệ mol là 1/6) [10], [12], [13] . Tỉ lệ khối lƣợng chol/SPC khác nhau tùy theo nghiên cứu. Trong nghiên cứu của Caddeo và cộng sự (2008) tỉ lệ chol/SPC = 1/5 tƣơng ứng tỉ lệ mol là 1/2 [13]. Trong nghiên cứu của Claudia Bonechi và công sự (2012), bào chế liposome RES với tỉ lệ mol chol/SPC = 1/1 và 1/2 [11]. Năm 2013, Bojana D. và cộng sự khảo sát tỉ lệ khối lƣợng chol/SPC = 1/2,3 tƣơng ứng tỉ lệ mol là 1/1 [10]. Các nghiên cứu trên, sử dụng chủ yếu phƣơng pháp hydrat hóa màng film [10], [11]. Tuy nhiên các nghiên cứu này cho hiệu suất liposome hóa thấp. Nghiên cứu của Lu X. Y. và cộng sự, khảo sát tỉ lệ khối lƣợng RES/SPC lần lƣợt từ 1/20; 1/30; 1/40; 1/50 (tƣơng ứng tỉ lệ mol là 1/6; 1/9; 1/12; 1/15). Tỉ lệ khối lƣợng chol/SPC lần lƣợt là 1/5; 1/7,5; 1/10 (tƣơng ứng tỉ lệ mol từ 1/2,5;1/4; 1/5) bằng phƣơng pháp bốc hơi pha đảo cho hiệu suất liposome hóa cao (95 %), đồng thời quy trình bào chế đơn giản [26]. Do vậy, nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát tỉ lệ mol RES/SPC từ 1/6; 1/9; 1/12; 1/15, tỉ lệ chol/SPC là 1/2; 1/2; 1/4 và 1/5 bằng phƣơng pháp bốc hơi pha đảo nhằm đƣa ra tỉ lệ có hiệu suất liposome hóa tối ƣu phù hợp với phƣơng pháp nghiên cứu.
Khi giảm tỉ lệ RES/SPC, hiệu suất liposome hóa tăng lên, có thể giải thích do RES nằm trong màng PL kép, nếu tỉ lệ RES cao vƣợt quá khả năng tải thuốc của liposome thì RES không đƣợc bao hết dẫn đến dƣ thừa và tồn tại dƣới dạng hòa tan hoặc kết tủa trong môi trƣờng nƣớc và sẽ bị loại đi khi
thẩm tách, do đó tỉ lệ thuốc đƣợc tải vào liposome so với tổng lƣợng RES sử dụng sẽ thấp. Khi giảm tỉ lệ RES so với SPC thì lƣợng RES đƣợc SPC bao gói cũng sẽ tăng đến khi toàn bộ RES đƣợc bao trong liposome thì hiệu suất này sẽ không tăng nữa, việc tăng SPC không giúp làm tăng hiệu suất liposome hóa, hơn nữa việc tăng SPC trong khi không giúp tăng hiệu suất liposome hóa cũng gây tốn kém hóa chất khi sản xuất quy mô lớn.
Khi giảm tỉ lệ chol/SPC, hiệu suất liposome hóa tăng đáng kể. Công thức có tỉ lệ chol cao (chol/SPC = 1/2) cho hiệu suất liposome hóa thấp nhất. Nguyên nhân là do cả chol và RES cùng nằm trong màng SPC, mà SPC chỉ có một giới hạn nhất định, khi tỉ lệ chol cao, nó sẽ cạnh tranh vị trí trong màng với RES và đẩy RES ra khỏi màng dẫn đến giảm hiệu suất liposome hóa. Khi tỉ lệ chol giảm, không gian trong màng đƣợc bảo vệ bởi SPC tăng lên làm cho lƣợng RES đƣợc vào bên trong màng liposome tăng, do đó tăng hiệu suất liposome hóa. Tuy nhiên, chol có vai trò ổn định màng, làm tăng độ cứng của màng, tăng sức chịu đựng của liposome dƣới áp lực thẩm thấu và bảo vệ liposome khỏi tƣơng tác với protein trong dịch sinh học, khi tỉ lệ chol quá thấp có thể gây tách pha và làm chol phân bố không đồng đều trong màng. Do vậy chúng tôi chỉ dừng nghiên cứu ở tỉ lệ chol/SPC = 1/5.
3.2.3.2. Ảnh hƣởng của các yếu tố thuộc quy trình bào chế
Trong quy trình bào chế, giai đoạn tạo nhũ tƣơng nƣớc/dầu rất quan trọng. Khi thêm pha nƣớc vào pha dung môi hữu cơ, do không trộn lẫn với nƣớc, nên pha dung môi hữu cơ tồn tại tách riêng với pha nƣớc, do đó cần sử dụng năng lƣợng siêu âm đủ lớn để tạo nhũ tƣơng ổn định. Một số nghiên cứu trƣớc đó dùng siêu âm bể để tạo nhũ tƣơng N/D, nhƣ nghiên cứu của Lu X. Y. (siêu âm bể trong vòng 30 phút) [26], chúng tôi cũng thử biện pháp dùng bể siêu âm. Tuy nhiên, năng lƣợng không đủ lớn nên không tạo thành nhũ tƣơng. Do vậy, chúng tôi dùng siêu âm cầm tay và siêu âm liên tục để tạo đƣợc nhũ
tƣơng đồng nhất. Quá trình siêu âm có kết hợp làm lạnh để tránh hiện tƣợng quá nhiệt có thể gây oxy hóa SPC và RES.
Khi thay đổi tỉ lệ RES/SPC cũng nhƣ tỉ lệ chol/SPC thì KTTP và phân bố KTTP thay đổi không theo quy luật, có thể giải thích do năng lƣợng siêu âm phân tán không đồng đều giữa các vị trí: Các tiểu phân nằm càng gần que siêu âm thì chịu tác động lực càng lớn dẫn đến bị làm nhỏ ở mức độ lớn hơn những tiểu phân nằm xa hơn, quá trình siêu âm chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố, nhƣ: Quá trình lắc khi siêu âm, thể tích dịch khi siêu âm… do đó, kích thƣớc tiểu phân thu đƣợc khá lớn, phân bố kích thƣớc tiểu phân rộng và không có sự khác biệt nhiều giữa các mẫu. Do đó, rất khó để so sánh các mẫu với nhau thông qua KTTP và PDI.
Nhiệt độ khi siêu âm nên đƣợc kiểm soát dƣới nhiệt độ chuyển pha của lipid, vì khi ở nhiệt độ cao hơn Tc của SPC, SPC tồn tại dạng vô định hình, liên kết lỏng lẻo. Do đó, dƣới năng lƣợng siêu âm cao có thể đẩy RES ra khỏi màng SPC kép. Ngoài ra, cả SPC và RES đều dễ bị oxy hóa, đặc biệt ở nhiệt độ cao mà quá trình siêu âm dễ gây quá nhiệt cục bộ, nên cần làm lạnh trong khi siêu âm cũng nhƣ chỉ siêu âm ngắt quãng.
Trong nghiên cứu của Bojana D. I. và cộng sự đã sử dụng li tâm để loại RES tự do [10]. Phƣơng pháp này tuy đơn giản, dễ thực hiện và có thể tính hiệu suất liposome hóa mà không cần phá màng liposome, nhƣng có thể cho sai số do khi li tâm, có thể có một lƣợng RES không tan kết tủa xuống đáy ống li tâm, nên không loại hết RES không đƣợc liposome hóa dẫn đến làm tăng hiệu suất so với hiệu suất thực. Nghiên cứu của chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp thẩm tách để loại RES tự do. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng trong nhiều nghiên cứu, theo đó có thể hòa tan và loại bỏ RES tự do [12].
Ether là dung môi dễ bay hơi, do vậy chỉ cần cất trong khoảng 30 phút là ether đã bay hơi hết. Tuy nhiên, cần cất thêm khoảng 1 h để loại hoàn toàn dung môi, tránh tồn dƣ dung môi gây độc và giảm độ ổn định của chế phẩm.
RES rất dễ bị giáng hóa bởi ánh sáng, do đó toàn bộ quá trình cần tránh ánh sáng.
KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Sau một thời gian thực hiện nghiên cứu tại bộ môn Hóa sinh và bộ môn Bào chế – trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả sau:
- Đã tạo đƣợc liposome RES từ phospholipid đậu nành bằng phƣơng pháp bốc hơi pha đảo có kích thƣớc khoảng 200 nm, hình cầu, không bị kết tụ, ít bị phá vỡ.
- Đã đánh giá ảnh hƣởng của tỉ lệ các thành phần trong công thức đến hiệu suất liposome hóa RES.
Kết quả cho thấy KTTP thu đƣợc khoảng 200 nm, PDI khoảng 0.4. Tỷ lệ mol RES/SPC: Chol phù hợp nhất là 1/12/2,4.
KIẾN NGHỊ
Do điều kiện thời gian cũng nhƣ điều kiện thực nghiệm còn hạn chế nên chúng tôi chỉ dùng lại ở việc chọn ra công thức bào chế liposome RES bằng phƣơng pháp bốc hơi pha đảo. Trong thời gian tới, chúng tôi đề nghị tiếp tục nghiên cứu các vấn đề sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tiếp tục khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố thuộc quy trình bào chế nhƣ nhiệt độ và thời gian cất quay, thời gian siêu âm đến các thông số: Hiệu
suất liposome hóa, KTTP và phân bố KTTP.
- Nghiên cứu so sánh liposome tạo thành theo phƣơng pháp siêu âm với các phƣơng pháp làm nhỏ KTTP khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2008), Kỹ thuật bào chế và sinh dược học các dạng thuốc, Tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 233-238.
2. Nguyễn Thanh Hà (2010), Nghiên cứu định tính và định lượng Resveratrol trong viên vang không độ và nguyên liệu chiết xuất vang nho bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Đại học Dƣợc Hà
Nội, Hà Nội.
3. Nguyễn Hải Nam, Lã Hải Chung (2007), “Phân lập Resveratrol và emodin từ Cốt khí củ (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc) trồng ở Việt Nam”,
Tạp chí dược học, 369, 7 – 10.
4. Ngô Thị Bích Phƣợng (2013), Nghiên cứu bào chế liposome amphotericin
B bằng phương pháp bốc hơi pha đảo, Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội.
5. Nguyễn Đình Tuấn, Nguyễn Hải Nam, Nguyễn Tiến Vững (2007), “Ứng dụng LC-MS định lƣợng resverastrol trong cốt khí củ”, Tạp chí dược học, 379, 13-16.
6. Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội (2005), Một số chuyên đề về bào chế hiện
đại, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 172-185.
Tài liệu tiếng anh
7. Akbarzadeh A. et al. (2013), “Liposome: classification, preparation, and applications”, Nanoscale Research Letters, 8(102).
8. Athar M., Back J. H., Tang X., Kim K. H., Kopelovich L., David R. B., Arianna L. K. (2007), “Resveratrol: A review of preclinical studies for human cancer prevention”, Toxicology and Applied Pharmacology, 224,
274 – 283.
9. Baur J. A., Sinclair D. A. (2006), “Therapeutic potential of resveratrol: the in vivo evidence”, Nature reviews Drug discovery, 5(6), 493-506.
10. Bojana D. I.., Ivana T. K., Zvonar A., Verica B., Gaˇsperlin M., Viktor A. N., Branko M. B. (2013), “Resveratrol loaded liposomes produced by different techniques”, Innovative Food Science and Emerging Technologies.
11. Bonechi C. et al. (2012), “Using Liposomes as Carriers for Polyphenolic Compounds: The Case ofTrans-Resveratrol”, Plos one, 7, 1 - 11.
12. Caddeo C., Manconi M., Fadda A. M., Lai F., Lampis S., Diez-Sales O., Sinico C. (2013), “Nanocarriers for antioxidant resveratrol: Formulation approach, vesicle self-assembly and stability evaluation”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 111, 327 – 332. 13. Caddeo C., Teskaˇc K., Sinico C., Kristl J. (2008), “Effect of resveratrol
incorporated in liposomes on proliferation and UV-B protection of cells”,
International Journal of Pharmaceutics, 363, 183 – 191.
14. Camont. L. (2009), “Simple spectrophotometric assessment of the trans- /cis-resveratrol ratio in aqueous solutions”, Analytica Chimica Acta, 634,
121 – 128.
15. Coimbra M. et al. (2011), “Improving solubility and chemical stability of natural compounds for medicinal use by incorporation into liposomes”, International Journal of Pharmaceutics, 416, 433 – 442.
16. Cortesi R. (1999), “Preparation of liposomes by reverse-phase evaporation using alternative organic solvents”, Journal of microencapsulation, 16(2), 251 - 256.
17. Dua J. S., Rana A. C., Bhandari A. K. (2012), ”Liposome: methods of preparation and applications”, Int J Pharm Stud Res, 3, 14-20.
18. Evjen T.J., Nilssen E.A., Rognvaldsson., et al. (2010), “Distearoylphosphatidyl ethanolamine-based liposomes for ultrasound- (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mediated drug delivery”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 75, 327-333.
19. Frkmont L. (2000), “Biological effect of Resveratrol”, Life Sciences, 66,
663 – 673.
20. Goh K. P., Lee H. Y., Lau D. P., Supaat W., Chan Y. H., Koh A. F. Y. (2014), “Effects of Resveratrol in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus on Skeletal Muscle SIRT1 Expression and Energy Expenditure”,
International Journal of Sport Nutrition and Exercise Metabolism, 24 (1),
2 - 13.
21. Huang J., Jeffrey T. B., Gerald W. F. (1999), “Maximum solubility of cholesterol in phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine bilayers”, Biochimica et Biophysica Acta, (1417), 89 - 100.
22. Jesorka A., Orwar O. (2008), “Liposomes: technologies and analytical applications”, Annual Review of Analytical, 1, 801 - 382.
23. Joseph A. B. and David A. S. (2006), “Therapeutic potential of resveratrol: the in vivo evidence”, Nature Reviews Drug Discovery, 5,
493 - 506.
24. Kopp P. (1998), “Resveratrol, a phytoestrogen found in red wine. A possible explanation for the conundrum of the'French paradox'?”, European Journal of Endocrinology, 138(6), 619-62056
25. Kristl J., Teska ˇc K., Caddeo C., Abramovic Z., ˇSentjurc M. (2009), “Improvements of cellular stress response on resveratrol in liposomes”,
Eur.J.Pharm. Biopharm, 73, 253 – 259.
26. Lu X. Y., Hu S., Jin Y., and Qiu L. Y. (2012), “Application of liposome