- Lập bảng thống kê số liệu theo các chỉ số đã nghiên cứu.
- Sử dụng phần mềm Microsoft Excell để tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn SD.
-So sánh hai giá trị trung bình với mức ý nghĩa α
| ̅ ̅|
√
Trong đó:
̅ : giá trị trung bình của đại lƣợng X.
̅ : giá trị trung bình của đại lƣợng Y.
n: số lần thực hiện của X; m: số số lần thực hiện của Y.
: độ lệch chuẩn của X; : độ lệch chuẩn của Y.
Nếu > xα hai giá trị trung bình khác biệt có ý nghĩa thống kê. Nếu < xα hai giá trị trung bình khác biệt không có ý nghĩa thống kê. xα đƣợc tra trong bảng phân phối chuẩn sao cho F(xα) = 1- α/2.
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. KẾT QỦA
Kết quả quét phổ hấp thụ của RES trong môi trƣờng đệm PBS pH 7,4 và Triton X-100 1 % cho thấy bƣớc sóng hấp thụ cực đại của RES λmax = 308,5 nm, do đó sẽ đo độ hấp thụ của RES tại 308,5 nm.
3.1.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng RES 3.1.1.1. Khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp 3.1.1.1. Khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp
Đo độ hấp thụ của cùng một mẫu thử tại các thời điểm khác nhau, kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.
Bảng 3: Độ hấp thụ của dung dịch RES trong môi trƣờng đệm PBS pH 7,4 và Triton 1 % tại các thời điểm sau khi pha
Thời điểm Độ hấp thụ 0h 0,328 1h 0,329 2h 0,324 3h 0,321 4h 0,326 5h 0,332 Trung bình 0,327 SD 0,004 RSD % 1,20 %
Kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo tại cùng một thời điểm.
Từ bảng trên cho thấy phƣơng pháp có độ lặp lại cao với giá trị RSD = 1,2 % (< 2 %)
3.1.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tá dƣợc
Quét phổ hấp thụ của dung dịch sau khi phá liposome trắng và pha loãng bằng Triton 9/1 cho thấy SPC và chol trong môi trƣờng đệm PBS pH 7,4 và
Triton 1 % không hấp thụ quang tại bƣớc sóng 308,5 nm. Do đó, SPC và chol không ảnh hƣởng đến phép định lƣợng RES sử dụng trong nghiên cứu này.
3.1.1.3. Khảo sát mối tƣơng quan giữa độ hấp thụ và nồng độ resveratrol
Kết quả mối tƣơng quan giữa độ hấp thụ (As) và nồng độ RES (Cs) đƣợc thể hiện trong bảng 4.
Bảng 4. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ RES trong môi trƣờng đệm PBS pH 7,4 và Triton 1 %
STT 1 2 3 4 5 6
Thể tích
dung dịch gốc(ml) 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75
Nồng độ (µg/ml) 2 3 4 5 6 7
Hình 6. Đồ thị sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ RES trong môi trƣờng đệm PBS pH 7,4 và Triton 1%
Nhận xét: trong khoảng nồng độ khảo sát (2 – 7 µg/ml), độ hấp thụ của dung dịch RES phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ, đƣờng chuẩn thu đƣợc có
y = 0.1117x + 0.0015 R² = 0.9997 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Đ ộ hấp thụ Nồng độ (µg/ml)
dạng đƣờng thẳng, phƣơng trình hồi quy: y = 0,111x + 0,001, với hệ số tƣơng quan R² = 0.999 ≈ 1.
Phƣơng pháp định lƣợng RES bằng đo quang có độ lặp lại cao, có tính tuyến tính (trong khoảng nồng độ khảo sát: 2 – 7 µg/ml) và không bị ảnh hƣởng bởi SPC và chol, do vậy có thể sử dụng phƣơng pháp đo quang trong môi trƣờng đệm PBS pH 7,4 và Triton X-100 1 % tại bƣớc sóng 308,5 nm trong khoảng nồng độ trên để định lƣợng RES trong mẫu liposome.
3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ mol các thành phần trong công thức đến KTTP, PDI và hiệu suất liposome hóa đến KTTP, PDI và hiệu suất liposome hóa
3.1.2.1. Tỉ lệ mol RES/SPC
Tiến hành bào chế liposome RES theo quy trình đƣợc nêu ở bƣớc 2.3.1, trong đó cố định tỉ lệ mol chol/SPC = 1/5, tỉ lệ mol RES/SPC lần lƣợt là 1/6; 1/9; 1/12; 1/15. Thể tích diethyl ether để hòa tan các thành phần là 30 ml, thể tích đệm PBS pH 7,4 là 10 ml. Tiến hành đánh giá KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất liposome hóa của các mẫu. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 6, bảng 7, hình 7.
Bảng 5. Thành phần công thức bào chế các mẫu khảo sát tỉ lệ mol RES/SPC
Tỉ lệ RES/SPC 1/6 1/9 1/12 1/15
mRES (g) 0,01 0,01 0,01 0,01
mSPC (g) 0,2036 0,3054 0,4072 0,5090
Bảng 6. Ảnh hƣởng của tỉ lệ RES/SPC đến kích thƣớc, phân bố kích thƣớc tiểu phân liposome
RES/SPC PDI Zaverage của hệ (d.nm) Peak KTTP trung bình mỗi peak theo đƣờng kính (d.nm) % theo thể tích Độ rộng peak(dnm) 1/6 0.371 233.2 1 199 16,8 93,48 2 3629 83,2 1446 3 0,000 0,0 0,000 1/9 0,457 256,7 1 155,9 18,4 106,4 2 3306 81,6 1485 3 0,000 0,0 0,000 1/12 0,405 237,9 1 77,4 17,4 31,23 2 348,8 9,9 142,6 3 4922 72,8 888,6 1/15 0,436 251,9 1 177,2 12,9 63,02 2 2602 87,1 889,5 3 0,000 0,0 0,000
Bảng 7. Ảnh hƣởng của tỉ lệ RES/SPC đến hiệu suất liposome hóa
Tỉ lệ mol
RES/SPC 1/6 1/9 1/12 1/15
Hình 7. Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa các mẫu liposome khảo sát tỉ lệ RES/SPC
(Kết quả ở mỗi tỉ lệ được tính bằng giá trị trung bình của 3 lần làm lặp lại ± SD)
Nhận xét:
Kết quả thu đƣợc từ bảng 6, 7 và hình 7 cho thấy khi thay đổi tỉ lệ RES/SPC và giữ nguyên tỉ lệ chol/SPC thì:
- Các mẫu thu đƣợc có kích thƣớc tiểu phân liposome khá lớn, phân bố KTTP rộng (PDI ~ 0,4), hệ kém đồng nhất. Cả 4 tỉ lệ đều cho hiệu suất liposome hóa trên 80 %, trong đó, 2 mẫu cho hiệu suất trên 90 % (1/12 và 1/15).
- Khi giảm tỉ lệ RES/SPC, hiệu suất tải thuốc tăng lên, từ 81,15 % (1/6) đến 88,11 % (1/9) và 95,66 % (1/12) (cao hơn có ý nghĩa thống kê so với mẫu tỉ lệ 1/9, p < 0,05), nhƣng khi giảm xuống còn 1/15 thì hiệu suất lại giảm nhẹ còn 94,81 % (không có ý nghĩa thống kê, p> 0,05).
Do đó, chúng tôi lựa chọn tỉ lệ RES/SPC = 1/12 cho hiệu suất tải thuốc cao nhất, kích thƣớc và PDI khá nhỏ để áp dụng cho các nghiên cứu sau.
81.15 88.11 95.66 94.81 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1:6 1:9 1:12 1:15 EE% Tỉ lệ RES : PL
3.1.2.2. Tỉ lệ mol chol/SPC
Bào chế liposome RES theo quy trình đƣợc nêu ở bƣớc 2.3.1, cố định tỉ lệ mol RES/SPC = 1/12, tỉ lệ mol chol/SPC lần lƣợt là 1/2;1/3;1/4;1/5. Thể tích diethyl ether để hòa tan các thành phần là 30 ml, thể tích đệm PBS pH 7,4 là 10 ml. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 9, 10, hình 8.
Bảng 8. Thành phần CTBC các mẫu khảo sát tỉ lệ mol Chol/SPC
Tỉ lệ Chol/SPC 1/2 1/3 1/4 1/5
mRES (g) 0,01 0,01 0,01 0,01
mSPC (g) 0,4072 0,4072 0,4072 0,4072
mChol (g) 0,1016 0,0677 0,0508 0,0406
Bảng 9.Ảnh hƣởng của tỉ lệ chol/SPC đến KT và phân bố KTTP liposome
Chol/SPC PDI Zaverage của hệ (d.nm) Peak KTTP TB mỗi peak theo đƣờng kính (d.nm) % theo thể tích Độ rộng peak(dnm) 1/2 0,397 237,8 1 92,55 26,7 37,16 2 444,8 17,8 198,9 3 5302 55,5 705,1 1/3 0,383 235,6 1 62,77 32,9 24,02 2 417,0 19,1 204,5 3 5103 48,0 843,2 1/4 0,433 234,1 1 83,18 32,2 35,42 2 494 20,3 221,7 3 5269 47,4 718,3 1/5 0,405 237,9 1 77,4 17,4 31,23 2 348,8 9,9 142,6 3 4922 72,8 888,6
Bảng 10. Ảnh hƣởng của tỉ lệ chol/SPC đến hiệu suất liposome hóa Tỉ lệ mol chol:SPC 1/2 1/2 1/4 1/5 Tỉ lệ mol RES/SPC : chol tƣơng ứng 1/12/6 1/12/4 1/12/3 1/12/2,4 EE% ± SD 85,85 ± 1,74 89,58 ± 0,71 93,55 ± 0,74 95,66 ± 1,07
(Kết quả ở mỗi tỉ lệ được tính bằng giá trị trung bình của 3 lần làm lặp lại ± SD)
Hình 8. Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa các mẫu liposome khảo sát tỉ lệ chol/SPC
Nhận xét:
- Từ kết quả trong bảng 9, 10 và hình 8 ta thấy, liposome thu đƣợc có kích thƣớc khá lớn và không có sự khác biệt nhiều giữa các mẫu, phân bố KTTP chƣa thật đồng đều, PDI còn khá lớn (khoảng 0,4), các mẫu đều có hiệu suất liposome hóa cao, từ hơn 85 đến hơn 95 %.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1:2 1:3 1:4 1:5 EE% Tỉ lệ chol:PL
- Khi giảm tỉ lệ chol trong mẫu, hiệu suất liposome hóa tăng khá nhiều. Mẫu có tỉ lệ chol cao nhất cho hiệu suất liposome hóa thấp nhất (85,85 %). Mẫu có tỉ lệ chol thấp nhất (1/5) cho hiệu suất liposome hóa cao nhất, cao hơn có ý nghĩa so với mẫu có tỉ lệ 1/4 (p < 0,05).
Do đó, từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi lựa chọn công
thức có tỉ lệ mol chol/SPC = 1/5 cho hiệu suất liposome hóa cao nhất để dùng trong các nghiên cứu sau này.
3.1.3. Đánh giá liposome tạo thành
Hỗn dịch liposome đồng nhất, màu trắng sữa, hơi nhớt, để một thời gian có thể bị lắng các tiểu phân, nhƣng phân tán đồng nhất trở lại sau khi lắc.
- Hình thái liposome: quan sát hình ảnh chụp TEM cho thấy liposome có hình cầu, phân bố kích thƣớc tiểu phân không đều, liposome ít bị phá vỡ, các tiểu phân liposome không bị kết tụ (hình 9) .
3.2. NHẬN XÉT, BÀN LUẬN 3.2.1. Về phƣơng pháp bào chế 3.2.1. Về phƣơng pháp bào chế
Trong rất nhiều phƣơng pháp bào chế liposome, phƣơng pháp bốc hơi pha đảo là một trong những phƣơng pháp đơn giản và cho hiệu suất cao [26]. Vì hạn chế của phƣơng pháp này là có thể tồn dƣ dung môi hữu cơ trong chế phẩm tạo thành, chúng tôi đã nghiên cứu và tham khảo nghiên cứu của Ngô Thị Bích Phƣợng [4] quyết định lựa chọn thời gian cất quay là 1,5 h để loại hết dung môi. Chúng tôi đã thử bào chế liposome RES bằng phƣơng pháp hydrat hóa màng film sử dụng dung môi ethanol. Tuy nhiên, phƣơng pháp này cho hiệu suất liposome hóa không cao, chỉ khoảng 50 – 60 %, kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu bào chế liposome bằng phƣơng pháp hydrat hóa màng film [10],[11],[15].
Phƣơng pháp bào chế sử dụng trong nghiên cứu này cho hiệu suất liposome hóa cao hơn các nghiên cứu khác. So với phƣơng pháp hydrat hóa, màng film đƣợc sử dụng trong nghiên cứu của Claudia Bonechi và cộng sự cho hiệu suất liposome hóa khoảng 50 % [11], hay nghiên cứu của Bojana D. Isailovi´c và cộng sự chỉ cho hiệu suất tải thuốc dƣới 50 % (44,2 %) [10]. Phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu này cho hiệu suất cao hơn hẳn, từ 80 đến 90%, mẫu cao nhất cho hiệu suất 95.66% (bảng 7), ngoài ra, cả KTTP và PDI của liposome tạo ra trong nghiên cứu cũng thấp hơn đáng kể so với nghiên cứu của Claudia Bonechi và cộng sự (250 nm so với 350 nm)[11].
Nếu so sánh với nghiên cứu của Xin Y. L. và cộng sự [26], sử dụng cùng phƣơng pháp bào chế cũng nhƣ phƣơng pháp làm nhỏ KTTP, thì nghiên cứu này cho hiệu suất cao hơn, tuy nhiên, KTTP và PDI là lớn hơn (hiệu suất 95,66% so với 95%) (KTTP khoảng 250 nm và PDI khoảng 0.4 so với 100 nm, PDI < 0,2). Có thể do khi tiến hành chúng tôi đã cải tiến quy trình, không cất quay 20 phút nhƣ trong nghiên cứu của Xin Y. L. và cộng sự [26], mà
chúng tôi tiến hành cất quay thêm 1 h sau khi ether bay hơi hết, vì theo
Cortesi R. ether tồn dƣ trong chế phẩm có thể gây rò rỉ dƣợc chất, ngoài ra chúng tôi còn tiến hành làm lạnh mẫu bằng nƣớc đá khi siêu âm để tránh hiện tƣợng quá nhiệt gây oxy hóa RES [16]
Về phƣơng pháp làm nhỏ KTTP, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp siêu âm trong nghiên cứu, bởi phƣơng pháp này đơn giản, thời gian tiến hành nhanh và không cần thiết bị quá phức tạp. Tuy nhiên, liposome thu đƣợc có kích thƣớc tiểu phân khá lớn, phân bố KTTP chƣa đồng nhất (bảng 6, 7), cũng nhƣ nghiên cứu chỉ mới tiến hành siêu âm trong thời gian 5 phút mà chƣa khảo sát đƣợc thời gian siêu âm khác nhau. Do vậy, cần có thêm các nghiên cứu tiếp theo khảo sát ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến KTTP, PDI và hiệu suất liposome hóa cũng nhƣ so sánh phƣơng pháp siêu âm với các phƣơng pháp làm nhỏ kích thƣớc tiểu phân khác nhƣ phƣơng pháp đẩy qua màng.
3.2.2. Về phƣơng pháp định lƣợng RES
Hiện nay trên thế giới cũng nhƣ trong nƣớc đã áp dụng rộng rãi các phƣơng pháp định lƣợng RES hiện đại, cho độ chính xác cao nhƣ: HPLC, LC-MS [2], [5], [12]. Phƣơng pháp định lƣợng bằng đo độ hấp thụ quang khá cổ điển và ít đƣợc áp dụng. Tuy nhiên, ƣu điểm của phƣơng pháp này là đơn giản, cho kết quả nhanh Theo Camont L. và cộng sự, định lƣợng RES bằng phƣơng pháp đo quang cho kết quả khác biệt không đáng kể so với dùng HPLC [14]. Do vậy, chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp đo quang để định lƣợng RES.
Để định lƣợng RES đƣợc tải trong liposome, chúng tôi tiến hành phá màng bằng Triton X-100 1 %, sau đó pha loãng để đo quang. Vì phổ hấp thụ của RES trong các môi trƣờng khác nhau là khác nhau, chúng tôi tiến hành quét lại phổ hấp thụ của RES trong môi trƣờng Triton 1 % và đệm PBS pH 7,4, cho thấy λmax của RES trong môi trƣờng này là 308,5 nm (trong nƣớc là 304 nm) [41].
3.2.3. Ảnh hƣởng của các yếu tố công thức và quy trình bào chế tới tính chất hệ liposome tạo thành tính chất hệ liposome tạo thành
3.2.3.1. Ảnh hƣởng của công thức bào chế
PL là thành phần cơ bản cấu tạo liposome, chol đƣợc thêm vào đóng vai trò ổn định màng. Các nghiên cứu trƣớc đây đã sử dụng các phƣơng pháp bào chế khác nhau với tỉ lệ RES/SPC/chol khác nhau. Thông thƣờng, sử dụng tỉ lệ khối lƣợng RES/SPC = 1/20 (tƣơng ứng tỉ lệ mol là 1/6) [10], [12], [13] . Tỉ lệ khối lƣợng chol/SPC khác nhau tùy theo nghiên cứu. Trong nghiên cứu của Caddeo và cộng sự (2008) tỉ lệ chol/SPC = 1/5 tƣơng ứng tỉ lệ mol là 1/2 [13]. Trong nghiên cứu của Claudia Bonechi và công sự (2012), bào chế liposome RES với tỉ lệ mol chol/SPC = 1/1 và 1/2 [11]. Năm 2013, Bojana D. và cộng sự khảo sát tỉ lệ khối lƣợng chol/SPC = 1/2,3 tƣơng ứng tỉ lệ mol là 1/1 [10]. Các nghiên cứu trên, sử dụng chủ yếu phƣơng pháp hydrat hóa màng film [10], [11]. Tuy nhiên các nghiên cứu này cho hiệu suất liposome hóa thấp. Nghiên cứu của Lu X. Y. và cộng sự, khảo sát tỉ lệ khối lƣợng RES/SPC lần lƣợt từ 1/20; 1/30; 1/40; 1/50 (tƣơng ứng tỉ lệ mol là 1/6; 1/9; 1/12; 1/15). Tỉ lệ khối lƣợng chol/SPC lần lƣợt là 1/5; 1/7,5; 1/10 (tƣơng ứng tỉ lệ mol từ 1/2,5;1/4; 1/5) bằng phƣơng pháp bốc hơi pha đảo cho hiệu suất liposome hóa cao (95 %), đồng thời quy trình bào chế đơn giản [26]. Do vậy, nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát tỉ lệ mol RES/SPC từ 1/6; 1/9; 1/12; 1/15, tỉ lệ chol/SPC là 1/2; 1/2; 1/4 và 1/5 bằng phƣơng pháp bốc hơi pha đảo nhằm đƣa ra tỉ lệ có hiệu suất liposome hóa tối ƣu phù hợp với phƣơng pháp nghiên cứu.
Khi giảm tỉ lệ RES/SPC, hiệu suất liposome hóa tăng lên, có thể giải thích do RES nằm trong màng PL kép, nếu tỉ lệ RES cao vƣợt quá khả năng tải thuốc của liposome thì RES không đƣợc bao hết dẫn đến dƣ thừa và tồn tại dƣới dạng hòa tan hoặc kết tủa trong môi trƣờng nƣớc và sẽ bị loại đi khi
thẩm tách, do đó tỉ lệ thuốc đƣợc tải vào liposome so với tổng lƣợng RES sử dụng sẽ thấp. Khi giảm tỉ lệ RES so với SPC thì lƣợng RES đƣợc SPC bao gói cũng sẽ tăng đến khi toàn bộ RES đƣợc bao trong liposome thì hiệu suất này sẽ không tăng nữa, việc tăng SPC không giúp làm tăng hiệu suất liposome hóa, hơn nữa việc tăng SPC trong khi không giúp tăng hiệu suất liposome hóa cũng gây tốn kém hóa chất khi sản xuất quy mô lớn.
Khi giảm tỉ lệ chol/SPC, hiệu suất liposome hóa tăng đáng kể. Công thức