6. Điểm mới của đề tài
3.2.1. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men kombucha
nấm men N1, N2, N3, N4,, 5 chủng vi khuẩn V1, V2, V3, V4, V5 chọn làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ
3.2.1. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ Phú Thọ
Bƣớc 1: Quan sát hình thái tế bào chủng nấm men trên kính hiển vi quang học
Từ các mẫu trên, tiến hành nhuộm đơn 4 chủng nấm men phân lập đƣợc. Kết quả quan sát thấy tế bào nấm men có hình ovan, hình thuôn nhọn 2 đầu, sinh trƣởng theo kiểu nảy chồi và phân cắt.
31 Hình 3.1. Hình thái tế bào chủng nấm men N1 (x1000 lần) Hình 3.2. Hình thái tế bào chủng nấm men N2 (x1000 lần) Hình 3.3. Hình thái tế bào chủng nấm men N3(x1000 lần) Hình 3.4. Hình thái tế bào chủng nấm men N4 (x1000 lần)
Nấm men có vai trò quan trọng trong quá trình lên men kombucha và chất lƣợng của kombucha. Vì vậy, khi tuyển chọn cần lấy đƣợc chủng tốt nhất dựa vào một số chỉ tiêu nhƣ:
Có hoạt lực lên men cao
Có khả năng kết lắng tốt và làm trong sản phẩm
Bƣớc 2: Đánh giá khả năng lên men của các chủng nấm men
Trong quá trình lên men thì hoạt lực lên men đƣợc đánh giá bằng hàm lƣợng CO2 sinh ra. Lƣợng CO2 sinh ra càng nhiều, thoát ra ngoài môi trƣờng
32
thì trọng lƣợng bình lên men càng giảm. Điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Căn cứ vào kết quả nghiên cứu của một số tác giả chỉ ra thời gian lên men cho sản phẩm thƣờng là 7 ngày. Tiến hành thí nghiệm lên men sau 7 ngày và xác định hàm lƣợng CO2 của 4 chủng, kết quả thí nghiệm đƣợc dẫn ra ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hàm lƣợng khí CO2 giải phóng sau 7 ngày lên men của 4 chủng nấm men
Chủng nấm men N1 N2 N3 N4
Lƣợng CO2 1,75 ± 0,02 2,3 ± 0,035 2,75 ± 0,02 1,5 ± 0,03 Kết quả nghiên cứu cho thấy trong 4 chủng thì chủng N2, N3 có hoạt lực lên men mạnh nhất, lƣợng CO2 thoát ra nhiều. Sự phát triển nhanh của tế bào nấm men làm cho vi khuẩn, nấm men dại khó xâm nhập. Ngoài khả năng sinh CO2 chất lƣợng sản phẩm còn phụ thuộc vào độ trong, màu sắc, mùi vị, vì vậy chúng tôi khảo sát tiếp khả năng kết lắng làm trong sản phẩm cuả 4 chủng nghiên cứu.
Bƣớc 3: Khả năng kết lắng
Tiến hành hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat rồi lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 5 phút., kết quả thí nghiệm đƣợc dẫn ra trên bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khả năng kết lắng của 4 chủng nấm men
Tên chủng N1 N2 N3 N4
Chiều cao cột sinh khối (mm)
33
Từ kết quả ở bảng 3.4, thấy rằng chủng nấm men N3 có khả năng kết lắng tốt nhất. Qua kết quả nghiên cứu trình bày trên bảng 3.3 và bảng 3.4 quyết định giữ chủng N3 làm đối tƣợng nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ
Bƣớc 1: Tiến hành nhuộm Gram các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc, kết quả 5 chủng vi khuẩn này đều bắt màu hồng của thuốc nhuộm ( Gram âm) có dạng hình que ngắn, tế bào xếp dạng đơn, đôi, hoặc chuỗi ngắn.
Các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha bao gồm vi khuẩn Gram dƣơng (vi khuẩn lactic) và vi khuẩn Gram âm (vi khuẩn Acetobacter). Vì các mẫu vi khuẩn phân lập đƣợc đều là vi khuẩn Gram âm, chính vì vậy chúng tôi tiến hành sơ tuyển bằng cách lựa chọn các mẫu vi khuẩn
Acetobacter có khả năng tạo màng kombucha.
Hình 3.5. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn V1 (x1000 lần)
Hình 3.6. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn V2(x1000 lần)
34
Hình 3.7. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn V4 (x1000 lần)
Hình 3.8. Hình thái tế bào chủng vi khuẩn V5 (x1000 lần)
Bƣớc 2: Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh acid. Theo Bergey [1] các chủng Acetobacter có khả năng oxy hóa acetate, trong môi trƣờng có chứa calcium acetate, các chủng vi khuẩn thuộc chi Acetobacter có khả năng sử dụng muối acetate làm nguồn cacbon. Các mẫu vi khuẩn có khả năng sinh acid, acid này phân giải CaCO3 trong môi trƣờng do đó xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vòng sáng nhỏ trong suốt. Kết quả thu đƣợc 2 chủng V2, V5 sinh acid.
Hình 3.9. Khả năng oxy hóa acetate của chủng vi khuẩn V2
Bƣớc 3. Khả năng tổng hợp cellulose Quan sát sự tạo thành màng ta thấy:
35
Vi khuẩn V1 tạo thành màng nhầy nhẵn, xuất hiện váng trên bề mặt Vi khuẩn V2 tạo thành màng nhẵn dai
Vi khuẩn V3 tạo thành màng mỏng dễ tan rã Vi khuẩn V4, V5 tạo thành màng nhăn nheo
Nhỏ dung dịch Lugol và H2SO4 60% lên mặt lớp màng của 5 mẫu vi khuẩn thấy chủng vi khuẩn V1,V2, V5 xuất hiện màu lam. Do màng của vi khuẩn tạo thành có bản chất là cellulose nên màng này sẽ bắt màu xanh với iốt, các chủng còn lại không xuất hiện màu.
Bƣớc 4.Kiểm tra hoạt tính catalase
Kiểm tra hoạt tính catalase thu đƣợc kết quả là cả 5 mẫu vi khuẩn đều có phản ứng catalase dƣơng tính.
Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tƣợng sủi bọt khí (hình 3.10) Chứng tỏ oxy đƣợc giải phóng ra, hay nói cách khác dƣới tác dụng của enzyme catalase phân giải H2O2 theo phƣơng trình:
2 2 2 2
1 2
Catalase
H O H O O
Hình 3.10. Thử hoạt tính catalase trên chủng vi khuẩn V2
Bƣớc 5. Khả năng sinh sắc tố nâu
Khi nuôi cấy 5 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn trên môi trƣờng thạch và dịch thể, không thấy hình thành sắc tố nâu, điều đó chứng tỏ rằng những
36
chủng vi khuẩn Acetobacter không hình thành sản phẩm 2,5-dixeto gluconic acid và - propyonic cho nên dịch nuôi cấy không màu. Kết quả: 5 mẫu vi khuẩn đều không thấy hình thành sắc tố nâu.
Bảng 3.5. Đặc tính sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn Acetobacter phân lập đƣợc từ trà Phú Thọ STT Tên chủng Đặc điểm V1 V2 V3 V4 V5 1 Bắt màu hồng khi nhuộm Gram + + + + + 2 Tạo acid acetic - + - - + 3 Hoạt tính catalase + + + + + 4 Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu - - - - - 5 Khả năng tổng hợp cellulose + + - - + Chú thích: +: Kết quả dƣơng tính - : Kết quả âm tính
Bƣớc 6:Tiến hành thí nghiệm lên men từng chủng vi khuẩn
Tiến hành thí nghiệm lên men từng chủng vi khuẩn thu đƣợc theo tỉ lệ 20g trà, 100g đƣờng /1000ml nƣớc. Sau 7 ngày lên men tiến hành xác định hàm lƣợng acid tổng số đƣợc tạo ra bằng chuẩn độ với NaOH có
37
phenolphtalain 0,1% làm chỉ thị và đánh giá cảm quan màng của 5 chủng vi khuẩn. Chuẩn độ xác định hàm lƣợng acid tổng số tạo thành, lặp lại 3 lần một mẫu, kết quả thu đƣợc ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Hàm lƣợng acid tổng số sinh ra và chất lƣợng cảm quan sản phẩm từ 5 chủng vi khuẩn STT Chủng Hàm lƣợng acid tổng số Chất lƣợng cảm quan M ± m M 1 V1 22 ± 0,05 17 2 V2 30 ± 0,04 17,4 3 V3 18 ± 0,027 15,5 4 V4 21 ± 0,035 16 5 V5 17,5 ± 0,06 15 6 V6 18 ± 0,038 15,5
Căn cứ vào khả năng sinh acid và chất lƣợng cảm quan sản phẩm đƣợc lên men từ 5 mẫu vi khuẩn Acetobacter, chúng tôi thấy chủng vi khuẩn V2 có khả năng sinh acid cao và cho sản phẩm có chất lƣợng cảm quan tốt.
Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chủng V2 làm đối tƣợng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Như vậy, tuyển chọn được chủng nấm men N3 và chủng vi khuẩn V2 có
khả năng lên men kombucha tốt nhất từ trà Phú Thọ, đã xác định được một số đặc tính sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn tuyển chọn.
38
3.3. Động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn, nấm men tuyển chọn; ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên men kombucha từ ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ
3.3.1. Động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn, nấm men tuyển chọn
Trong qúa trình lên men kombucha giai đoạn nhân giống chiếm một thời gian ngắn khoảng 24 – 48 h, nhƣng nó lại đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình tăng nhanh số lƣợng của tế bào vi sinh vật.
Tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng số 2 (môi trƣờng nhân giống ) ở điều kiện môi trƣờng 350
C,nuôi trên máy lắc 135 vòng/phút với số lƣợng tế bào chủng nấm men N3 ban đầu là 3,5.106/ml ,chủng vi khuẩn V2 là 2x106 tế bào/ml, sau những khoảng thời gian định sẵn, dịch nuôi cấy đƣợc lấy ra để xác định số lƣợng tế bào. Sử dụng phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào trong dịch nuôi cấy ở các thời điểm: 0,12, 24,36, 48, 60,72, 84,96 giờ. Mục đích là xác định động thái phát triển của chủng nấm men N3 và chủng vi khuẩn V2. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.12.
39
Bảng 3.5. Quá trình sinh trƣởng của chủng vi khuẩn V2 và nấm men N3
Thời gian (h) Chủng vi khuẩn V2 Chủng nấm men N3 Số lƣợng tế bào (x106) δ(%) Số lƣợng tế bào (x106) δ(%) 0 2 ± 0,0057 0,0001 3,5 ± 0,0057 0,0001 12 15 ± 1,57 0,0273 53 ± 1,17 0,0203 24 35 ± 0,77 0,0134 85 ± 1,76 0,0305 36 80 ± 1,41 0,0245 130 ± 1,258 0,0218 48 125 ± 1,61 0,028 125 ± 0,77 0,0134 60 134 ± 2,182 0,0378 87 ± 1,991 0,0345 72 145 ± 1,88 0,0326 65 ± 1,847 0,032 84 129 ± 1,54 0,0267 34 ± 1,55 0,027 96 83 ± 1,327 0,023 23 ± 1,17 0,0203
40
Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng chủng nấm men N3
Nhƣ vậy, chủng nấm men N3 và chủng vi khuẩn V2 có khả năng phát triển tốt và theo đúng động thái phát triển: Pha tiềm phát, pha logarit, pha cân bằng, pha suy vong. Chủng nấm men N3 ở 36h số lƣợng tế bào đạt cực đại và sau đó giảm dần, chủng vi khuẩn V2 số lƣợng tế bào đạt cực đại ở 72h và sau đó giảm dần.
Do đó, để thu được lượng sinh khối chủng nấm men N3 nhiều nhất và
khoẻ nhất ta sẽ nuôi cấy và tiến hành thu hoạch sinh khối sau 36 giờ. Để thu
được lượng sinh khối chủng vi khuẩn V2 nhiều nhất và khoẻ nhất ta sẽ nuôi
cấy và tiến hành thu hoạch sinh khối sau 72 giờ.
3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ
Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng tới quá trình lên men kombucha bao gồm các yếu tố: ảnh hƣởng của thời gian lên men; ảnh hƣởng của hàm lƣợng giống bổ sung ban đầu; ảnh hƣởng của độ pH ban đầu; ảnh hƣởng của nhiệt độ. Trong đó, ảnh hƣởng của hàm lƣợng giống đối với quá trình lên men kombucha đóng vai trò hết sức quan trọng, hàm lƣợng giống bổ sung chƣa đủ hoặc không tốt sẽ ảnh hƣởng đến chất lƣợng của kombucha, làm kombucha dễ bị nhiễm tạp, hàm lƣợng giống bổ sung quá cao sẽ làm quá trình lên men diễn ra nhanh, thời gian sử dụng sản phẩm ngắn, trong sản xuất ngoài yếu tố
41
chất lƣợng sản phẩm ngƣời ta còn chú trọng đến giá trị kinh tế vì vậy cần phải tìm đƣợc hàm lƣợng giống bổ sung thích hợp nhất, vừa tạo đƣợc sản phẩm kombucha có chất lƣợng tốt vừa hạ đƣợc giá thành.
3.3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng giống đối với quá trình lên men kombucha
Hàm lƣợng men giống đƣa vào là tác nhân chính của quá trình lên men kombucha. Hàm lƣợng men giống nhiều quá trình lên men đƣợc thúc đẩy nhƣng nếu nhiều quá sẽ xảy ra cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng đến lên men. Để xác định đƣợc hàm lƣợng men giống thích hợp, tiến hành thí nghiệm với hàm lƣợng men giống: 6%, 8%,10%,12% [3] trên chủng N3V2 đã tuyển chọn với tỷ lệ vi khuẩn: nấm men: 50:50 (thừa hƣởng kết quả nghiên cứu về hàm lƣợng giống bổ sung vào dịch trà của tác giả Lê Thị Huệ, Nghiên cứu một số chủng
vi khuẩn lên men kombucha từ trà Thái Nguyên, tác giả Lâm Thị Hồng Liên,
Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà
Giang). Sau 7 ngày lên men tiến hành đo hàm lƣợng acid sinh ra [6]. Kết quả
thu đƣợc trên bảng 3.8.
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng giống đến hàm lƣợng acid tổng số sinh ra Tỷ lệ giống(%) M ± m δ(%) Cv 6 25,5 ± 0,202 0,003 0,01 8 27,6 ± 0,173 0,003 0,01 10 29,5 ± 0,288 0,005 0,016 12 31,6 ± 0,196 0,004 0,012
42
Hình 3.14. Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng hàm lƣợng giống đến hàm lƣợng acid tổng số sinh ra
Từ kết quả trên bảng 3.8 nhận thấy tỷ lệ giống bổ sung 6% là không phù hợp, thời gian lên men diễn ra dài hơn, tốc độ lên men diễn ra chậm. Tỷ lệ giống bổ sung là 8% quá trình lên men tƣơng đối tốt, tuy nhiên chƣa thực sự tạo ra đƣợc hƣơng vị đặc trƣng của kombucha. Ở tỷ lệ giống bổ sung là 10% và 12% nhận thấy quá trình lên men diễn ra nhanh, sản phẩm tạo ra có mùi vị thơm ngon đặc trƣng. Khi tăng tỷ lệ giống thì thời gian lên men đƣợc rút ngắn (tùy thuộc hàm lƣợng dinh dƣỡng có trong dịch lên men). Tuy nhiên, tỷ lệ giống càng nhiều dẫn đến quá trình lên men diễn ra càng nhanh, lƣợng acid tạo ra càng nhiều làm cho sản phẩm nhanh chua sẽ ảnh hƣởng chất lƣợng sản phẩm.
Như vậy, để quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ được tốt, quyết định chọn tỷ lệ giống bổ sung ban đầu là 10%.
3.4. Lên men tạo sản phẩm kombucha từ trà Phú Thọ
3.4.1. Lên men kombucha
Lên men tạo sản phẩm kombucha là công việc khá đơn giản, tuy nhiên để tạo sản phẩm kombucha với chất lƣợng tốt, an toàn...cần phải sử dụng các loại nguyên liệu, hàm lƣợng giống bổ sung (vi khuẩn, nấm men) đúng loại và
43
tỷ lệ, đảm bảo yêu cầu vệ sinh. Về nguyên liệu trà, có thể tự lên men ở gia đình với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau (lá chè xanh, trà đen, trà lipton...) [6].
Chú ý: Dịch trà đƣờng để nguội sau đó mới bổ sung giống nếu không sẽ làm chết con nấm.
Không dùng các loại dụng cụ bằng sắt để lên men nên dùng bình thủy tinh, sứ hoặc plastic.
3.4.2. Thuyết minh quy trình Nguyên liệu: Nguyên liệu:
1 con nấm kombucha hoặc 10% dịch giống 20g trà Phú Thọ
100g đƣờng saccharose 1000 ml nƣớc
Bình thủy tinh, khăn vải.
* Giai đoạn 1: Chế biến dịch trà đường và lên men
Bước 1: Chế biến dịch trà
Đun sôi 1000ml nƣớc, ngâm 20g trà để khoảng 10 phút cho trà ngấm hoàn toàn.
Bước 2: Lọc
Mục đích: nhằm tách bã chè ra khỏi dịch trà, làm cho dịch trà trong không bị vẩn đục do đó làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men.
Bước 3: Bổ sung đường và làm nguội
Mục đích: là hạ thấp nhiệt độ của dịch trà, hạn chế sự xâm nhập của vi sinh vật và thuận tiện cho quá trình phối trộn, tránh làm mất hƣơng vị đặc trƣng của sản phẩm đồng thời bổ sung 100g đƣờng vào dịch trà.
44
Đây là quá trình lên men hiếu khí nên rất dễ nhiễm vi sinh vật lạ và đặc biệt là nấm mốc. Do đó cần đổ dịch lên men vào bình thủy tinh rửa thật sạch, lau khô và đậy kín bằng khăn vải đã tiệt trùng. Đổ trà đƣờng đã để nguội vào, thả nhẹ con nấm Kombucha hoặc bổ sung dịch giống tỷ lệ 10% (10% VK: 10% NM) vào dịch lên men, để nơi thoáng mát trong vòng 7 ngày là đƣợc.
* Giai đoạn 2: Hoàn thiện và thu sản phẩm
Bước 1: Thu dịch và lọc dịch lên men
Sau khi quá trình lên men kết thúc, vớt nấm kombucha, thu lấy dịch lên men đem lọc. Thao tác vớt nấm kombucha phải đảm bảo điều kiện vệ sinh nghiêm ngặt, hạn chế nhiễm vi sinh vật từ môi trƣờng vào.
Lọc dịch lên men: mục đích loại bỏ cặn, xác vi sinh vật sau quá trình