6. Điểm mới của đề tài
2.1.6. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
Thời gian: tháng 6 năm 2014 đến tháng 3 năm 2015
Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
19 Bảng 2.1. Các loại môi trƣờng sử dụng STT Thành phần Môi trƣờng phân lập (g/l) Môi trƣờng nhân giống (g/l) Môi trƣờng lên men (g/l) VK NM VK NM 1 Trà Phú Thọ 20 2 Glucose 20 50 20 50 3 KH2PO4 2 3 2 3 4 MgSO4.7H2O 2 2 2 2 5 (NH4)2SO4 3 2 3 2 6 Pepton 4 10 4 10 7 Agar 20 15-20 8 CaCO3 5 9 saccarozo 100
Các thành phần của môi trƣờng đƣợc hòa tan trong 1000ml nƣớc cất. Môi trƣờng phân lập và nhân giống của vi khuẩn đƣợc bổ sung acid acetic 2%, rƣợu etylic 2% sau khi thanh trùng.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp phân lập
Tiến hành phân lập trên các hộp petri để chọn một tập hợp vi sinh vật lên men trà kombucha. Sử dụng môi trƣờng nhƣ bảng trên.
Cách làm: môi trƣờng phân lập đƣợc khử trùng và đƣợc phân bố vào các hộp vô trùng petri để nguội theo phƣơng pháp Pasteru. Dịch trà kombucha đƣợc pha loãng từ 10-1
20
đều bằng máy vontex trong 10 phút thu đƣợc huyền phù vi sinh vật. Dùng đĩa petri đã vô trùng nhỏ 1,2 giọt huyền phù với độ pha loãng từ 10-5
-10-7 lên bề mặt thạch rồi dùng bàn trang vô trùng dàn đều. Gói kín lại và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 28-30o
C trong 2-3 ngày. Sau 2-3 ngày, dựa vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trƣng ra khỏi môi trƣờng phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ 4oC [10].
2.2.1.2. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram
Nhuộm Gram: Là phƣơng pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protit đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iot.
Để tiến hành phƣơng pháp nhuộm Gram cần lấy mẫu từ các chủng đã qua sơ tuyển làm tiêu bản. Khi đó tùy vào màu của tiêu bản thu đƣợc giúp ta phân biệt đƣợc vi khuẩn Gr- hay Gr+.
Cơ sở khoa học của các bƣớc nhuộm Gram nhƣ sau: Bƣớc nhuộm màu cơ bản bằng thuốc nhuộm tím Gential violet tất cả các vi khuẩn đều bắt màu tím. Nhuộm tăng cƣờng bằng dung dịch Lugol thuốc nhuộm này kết hợp với thuốc nhuộm Gential violet thành phức hợp bền màu hơn ở các vi khuẩn G+. Tẩy màu dùng chất tẩy màu (thƣờng là cồn 90%) tổ hợp Gential violet và dung dịch Lugol. Ở thành tế bào G- thì liên kết giữa tổ hợp thuốc nhuộm này lỏng lẻo hơn ở vi khuẩn Gram+ nên dễ bị rửa trôi.Nhuộm phân biệt bằng thuốc nhuộm khác (Fuchsin) nhằm nhuộm các tế bào đã tẩy màu thành một màu tƣơng phản với màu tím để dễ phân biệt. Sau khi nhuộm kép tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr- , bắt màu tím là vi khuẩn Gr+ . Vi khuẩn Gr- không có khả năng giữ màu này nên dễ bị rửa trôi bởi cồn. Chỉ khi nhỏ Fucshin vi khuẩn Gr- mới bắt màu hồng của Fucshin
21
Nhuộm đơn: Là nhuộm tế bào bằng một loại thuốc nhuộm. Toàn bộ tế bào bị bắt màu đậm của thuốc nhuộm đó. Bởi vậy, cách nhuộm này thƣờng dùng để quan sát hình dạng tế bào vi sinh vật. Tiến hành làm vết bôi vi sinh vật, sau đó nhỏ một, hai giọt fuchsin để hai phút, hong khô tiêu bản, lên kính.
Soi tiêu bản dƣới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóng đại 1000 lần) [10].
2.2.1.3. Phương pháp đếm số lượng tế bào trên thạch đĩa
Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi sinh vật, pha loãng theo phƣơng pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trƣờng thạch đĩa. Nuôi ở 30oC sau 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trƣờng đĩa petri, từ đó xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức:
N= A. 1000
100 . 1 10n
Trong đó: N- tổng số CFU trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu A- Số CFU trung bình đếm đƣợc trên mỗi đĩa petri
10-n - độ pha loãng dịch nuôi cấy
2.2.1.4. Bảo quản chủng giống
Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trƣờng giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày trong tủ ấm 30oC. Sau đó giữ trong tủ lạnh 4oC dùng cho nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần.
2.2.1.5. Phương pháp hoạt hóa
Giống từ ống nghiệm đƣợc bảo quản trong tủ lạnh, trƣớc khi đem sử dụng phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lƣợng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phƣơng pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trƣờng tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121oC trong 20 phút. Sau
22
đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ.
2.2.1.6. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men
Xác định hoạt lực lên men của mẫu nấm men đã đƣợc phân lập và tuyển chọn thông qua xác định hàm lƣợng CO2 thoát ra (g/l dịch lên men) bằng phƣơng pháp cân bình trọng lƣợng. Hàm lƣợng CO2 thoát ra càng nhiều thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt.
Phƣơng pháp cân bình trọng lƣợng: Dịch đƣợc lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trƣờng, có cùng một lƣợng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24h lên men đem cân trọng lƣợng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại [9].
2.2.1.7. Xác định khả năng kết lắng của nấm men
Hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (có pH: 4,5) đƣợc đựng trong các ống nghiệm có hình dạng và kích thƣớc nhƣ nhau với thể tích của dung dịch đệm và số lƣợng nấm men hoàn toàn bằng nhau. Lắc kỹ trên máy với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 5 phút, để lắng 12h. Lúc này toàn bộ khối dịch phân thành hai lớp (phía dƣới đáy của ống nghiệm là nấm men đã kết lắng). Tiến hành đo chiều cao lớp kết lắng của chủng nấm men trong từng ống nghiệm để xác định khả năng kết lắng của chủng nấm men. Ống nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất là chủng nấm men có độ kết lắng tốt nhất.
2.2.2. Phương pháp hóa sinh
2.2.2.1. Phát hiện khả năng oxy hóa acid acetic
Sử dụng môi trƣờng sau để thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn [4].
Thành phần (g/l): Cao nấm men : 10g Canxi acetat: 10g Thạch : 20g Nƣớc máy: 1000ml
23
pH : 7,0-7,2
Quan sát hiện tƣợng nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi là phản ứng dƣơng tính, ngƣợc lại là âm tính.
2.2.2.2. Phát hiện hoạt tính catalase
Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tƣợng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó đƣợc coi là có hoạt tính catalase, ngƣợc lại chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase.
2.2.2.3. Phát hiện khả năng tổng hợp xenlulose
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng dịch thể ở nhiệt độ 28-30oC trong vòng 3-4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60% nó chuyển hóa thành màu xanh lam.
2.2.2.4. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalain 0.1% làm chỉ thị
Cho vào cốc thủy tinh (loại 100ml hoặc 200ml) dịch lên men, thêm vào đó 1-2 giọt phenolphtalein 0,1% chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Chú ý chuẩn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt. Sau đó tính số gam acid tổng số trong 100ml dung dịch lên men theo công thức;
X= (V.K.100)/10 (g/ml)
Trong đó X: Số gam acid tổng số trong 100ml dung dịch lên men
V: Số ml NaOH 0,1n dùng để chuẩn độ 10ml dung dịch lên men K: Lƣợng acid tổng số tƣơng ứng với 1ml NaOH 0,1N (K=0,06)
10: Số ml dịch lên men đem chuẩn độ.
2.2.3. Phương pháp cảm quan
Sử dụng cơ quan cảm giác của con ngƣời để tìm hiểu mô tả và định lƣợng các chất cảm quan vốn có của thực phẩm.Cảm quan kombucha đƣợc đánh giá trên một số chỉ tiêu ở bảng 2.2.
24
Bảng 2.2.Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của Kombucha
Tên chỉ tiêu Điểm chƣa có trọng lƣợng Yêu cầu 1 2 3 Độ trong và màu sắc
5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ, mầu hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm
4 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, mầu đặc trƣng cho sản phẩm. 3 Chất lỏng trong, có tƣơng đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu hơi khác một
ít so với màu đặc trƣng của sản phẩm.
2 Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ thô trầm trọng, màu khác nhiều so với màu đặc trƣng của sản phẩm.
1 Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ trầm trọng, thô, màu không đặc trƣng cho sản phẩm. 0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng
Mùi
5 Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm.
4 Chƣa hoàn toàn hòa hợp, thơm đặc trƣng cho sản phẩm nhƣng hơi khó nhận thấy.
3 Hơi nồng, thoảng mùi phụ, ít đặc trƣng cho sản phẩm 2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trƣng cho sản phẩm 1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trƣng cho sản phẩm 0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng.
Vị
5 Hòa hợp, êm dịu, hoàn toàn đặc trƣng cho sản phẩm
4 Chƣa hoàn toàn hòa hợp, đặc trƣng cho sản phẩm bình thƣờng. 3 Chƣa hòa hợp, hơi gắt và xốc, ít đặc trƣng cho sản phẩm. 2 Đắng, xốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trƣng cho sản phẩm 0 Có vị lạ khó chịu của sản phẩm bị hỏng
Bảng 2.3. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu
Số thứ tự Chỉ tiêu Hệ số quan trọng 1 2 3 Độ trong và màu sắc Mùi Vị 0,8 1,2 2,0 Tổng cộng 4,0
25
Bảng 2.4. Bảng quy định đánh giá mức độ chất lƣợng sản phẩm
STT Mức chất
lƣợng Số điểm chung
Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình chƣa có trọng lƣợng của hội
đồng cảm quan 1 Loại tốt 18,6 – 20,0 Mùi : 4,8 Vị : 4,8 2 Loại khá 15,2 – 18,5 Mùi : 3,8 Vị : 3,8 3 Loại trung bình 11,2 – 15,1 Mỗi chỉ tiêu : 2,8 4 Loại kém 7,2 – 11,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,8 5 Loại rất kém 4,0 – 7,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,0 6 Loại hỏng 0 – 3,9 Mỗi chỉ tiêu nhỏ hơn 1,0
2.2.4. Phương pháp toán học
Xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp trong sách “Thống kê và ứng dụng” nhƣ:
Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm: 1 1 n i i X X n Trong đó: X: trung bình tổng thể
Xi : giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n n: số lần thí nghiệm
Trung bình bình phƣơng các sai lệch:
1 ) ( 1 2 n X X n i i
26 Trong đó: δ: độ lệch chuẩn
Xi : giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n X: trung bình tổng thể
Sai số đại diện của trung bình cộng: m n Hệ số biến thiên (Cv%): Cv%= X .100%
Trong đó: Cv: hệ số biến thiên của trung bình tổng thể δ: độ lệch chuẩn
27
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ
Nguyên liệu sử dụng là trà Phú Thọ và đƣờng để sản xuất kombucha. Trƣớc hết cần đun sôi 1000ml nƣớc, bổ sung 20g trà để trong thời gian 5 phút. Sau đó lọc lấy dịch trà đổ vào bình thủy tinh sạch, thêm 100g đƣờng khuấy đều, để nguội, bổ sung dung dịch giống hoặc con nấm kombucha. Sau 7 ngày ở 28o
C ta thu đƣợc kombucha, bao gồm dịch trà đƣờng lên men và miếng thạch nổi lên trên bề mặt. Dùng vải sạch lọc lấy dịch, tiến hành phân lập.
Môi trƣờng phân lập nấm men và môi trƣờng phân lập vi khuẩn đƣợc thanh trùng theo phƣơng pháp Pasteur sau đó đƣợc phân vào các đĩa petri đã vô trùng. Dịch kombucha đƣợc pha loãng từ 10-1 – 10-9, dùng pipet lấy 1 ml dịch huyền phù ở các nồng độ pha loãng khác nhau, mở hé đĩa petri nhỏ vào đó từ 1 – 2 giọt, dùng bàn trang vô trùng nhẹ nhàng dàn đều thể tích đó khắp bề mặt môi trƣờng. Nuôi trong tủ ấm 30oC trong thời gian khoảng 2 - 3 ngày.
3.1.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ Thọ
Sau 2-3 ngày kiểm tra đĩa petri. Kết quả phân lập cho thấy tỉ lệ nấm men có trong kombucha khá phong phú: Ở nồng độ pha loãng 10-3 phân lập đƣợc 5 chủng nấm men; nồng độ pha loãng 10-4
phân lập đƣợc 6 chủng nấm men; Ở nồng độ pha loãng 10-5 phân lập đƣợc 3 chủng nấm men; Ở nồng độ pha loãng 10-6 phân lập đƣợc 2 chủng nấm men. Ở nồng độ 10-7, 10-8, 10-9 số lƣợng khuẩn lạc ít nên lựa chọn không đảm bảo tính khách quan. Ở nồng độ 10-1, 10-2 số lƣợng khuẩn lạc quá lớn không chọn đƣợc chủng. Dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc và kích thƣớc khuẩn lạc trên đĩa petri và hình thái tế bào các chủng nấm men trên kính hiển vi quang học, thu đƣợc 4 chủng nấm men, đƣờng kính khuẩn lạc từ 1-3,5mm. Kết quả phân lập thể hiện ở bảng 3.1.
28
Bảng 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm men
STT Tên chủng Kích thƣớc khuẩn lạc (mm) Đặc điểm khuẩn lạc Hình ảnh 1 N1 1-1,5 Khuẩn lạc dạng tròn, màu trắng ngà. 2 N2 1,5-2,5 Khuẩn lạc dạng tròn, màu trắng ngà, bề mặt khuẩn lạc trơn bóng. 3 N3 2-3,5 Khuẩn lạc dạng tròn, màu trắng đục, bề mặt khuẩn lạc lồi, kích thƣớc đồng nhất. 4 N4 1,5-2,5 Khuẩn lạc dạng tròn, màu trắng đục, bề mặt khuẩn lạc ƣớt.
29
3.1.2. Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ Thọ
Môi trƣờng phân lập vi khuẩn đƣợc acid hóa bằng acid acetic góp phần ức chế sự phát triển của các chủng vi sinh vật khác. Tuy nhiên có nhiều chủng vi khuẩn có thể sống trong môi trƣờng có độ pH thấp. Sau 2-3 ngày kiểm tra các đĩa petri, kết quả thu đƣợc 5 chủng vi khuẩn có hình dạng, màu sắc khác nhau.
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số chủng vi khuẩn phân lập
STT Tên chủng Kích thƣớc khuẩn lạc (mm) Đặc điểm khuẩn lạc Hình ảnh 1 V1 1-1,5 Khuẩn lạc màu vàng, khô, rìa ngoài bằng phẳng. 2 V2 2-3,5 Khuẩn lạc màu trắng đục, bóng, nhầy, bề mặt khuẩn lạc nhô cao hình chóp nón. 3 V3 1-1,5 Khuẩn lạc màu cam, nhầy nhớt, bề mặt khuẩn lạc không nhô cao.
30
4 V4 2-3,5
Khuẩn lạc màu trắng trong, bóng và nhầy nhớt, bề mặt khuẩn lạc nhô cao.
5 V5 2-4
Khuẩn lạc màu trắng đục, có nhân tròn ở giữa, bề mặt khô, rìa ngoài có răng cƣa.
Như vậy, từ nguồn nguyên liệu là trà Phú Thọ phân lập được4 chủng
nấm men N1, N2, N3, N4,, 5 chủng vi khuẩn V1, V2, V3, V4, V5 chọn làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ
3.2.1. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ Phú Thọ
Bƣớc 1: Quan sát hình thái tế bào chủng nấm men trên kính hiển vi quang học
Từ các mẫu trên, tiến hành nhuộm đơn 4 chủng nấm men phân lập đƣợc. Kết quả quan sát thấy tế bào nấm men có hình ovan, hình thuôn nhọn 2