Trong quá trình lên men thì thời gian lên men là yếu tố quan trọng góp phần vào sự thành công của quá trình lên men rượu. Tuy nhiên, cũng cần xác định tỷ lệ bột men và thời gian thích hợp nhất để cho kết quả lên men tốt, mang lại hiệu quả cao. Ở đây ta bố trí từng tỷ lệ bột men với thời gian lên men khác nhau. Ở 3 nghiệm thức đầu tiên sử dụng 0,5% bột men với mật số là 6 x 108 tế bào/g. Nghiệm thức thứ 4, 5, 6 sử dụng 0,75% bột men với mật số là 9 x 108 tế bào/g. Nghiệm thức thứ 7, 8, 9 sử dụng 1% bột men với mật số là 1,2 x 109 tế bào/g. 3 nghiệm cuối cùng sử dụng 1,25% bột men với mật số là 1,5 x 109 tế bào/g. Quan sát các chỉ tiêu: pH sau lên men, Brix sau lên men, độ rượu ở 200C sau 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày.
Kết quả ở Bảng 5 cho thấy hàm lượng ethanol trong dịch đường hóa sau lên men của nghiệm thức 6 (mật số tế bào nấm men 9 x 108 tế bào/g và lên men 4 ngày) là cao nhất (11,66 %v/v). Nghiệm thứ 6 khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% với các nghiệm thức 1, 2, 3, 5, 8, 10, 12; tuy nhiên 7 nghiệm thức vừa nêu lại khác biệt không có ý nghĩa với nghiệm thức 4, 7, 9, 11 về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%.
So sánh kết quả lên men rượu của nghiệm thức 6 với khả năng lên men rượu (bột men Y3NT) của Hà Phương Thảo (2013) là cao hơn (11,66 %v/v so với 10,80 %v/v). Tuy mật số tế bào nấm men sử dụng ít hơn so với Hà Phương Thảo (9 x 108 tế bào/g < 3,7 x 109 tế bào/g) và thời gian lên men ngắn hơn (4 ngày < 5 ngày) nhưng độ rượu cao hơn điều đó cho thấy rằng, mật số nấm men quá cao và thời gian lên men dài sẽ làm ảnh hưởng đến khả năng lên men của nấm men. Bên cạnh đó độ pH cũng ảnh hưởng đến kết quả lên men, độ pH ở nghiệm thức 6 sau lên men là 4,10 nằm trong khoảng thích hợp cho lên men rượu 3,8 – 4,2 (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005) còn pH sau lên men rượu của bột men Y3NT là khá thấp chỉ còn 3,51.
Bảng 4. Khả năng lên men của từng tỷ lệ bột men qua các thời gian lên men khác nhau
pH Brix Nghiệm thức Mật số tế bào nấm men Số ngày lên men Trước lên men Sau lên men Trước lên men Sau lên men Độ rượu sau lên men ở 20oC (%v/v) 1 6 x 108 2 4,20 3,90c 20 8,70a 10,36abc 2 6 x 108 3 4,20 4,00bc 20 8,47b 10,20abc 3 6 x 108 4 4,20 4,13a 20 8,60ab 11,14ab 4 9 x 108 2 4,20 3,90c 20 8,40b 8,60c 5 9 x 108 3 4,20 4,00bc 20 8,60ab 10,57abc 6 9 x 108 4 4,20 4,10ab 20 8,40b 11,66a 7 1,2 x 109 2 4,20 4,00bc 20 8,60ab 9,16bc 8 1,2 x 109 3 4,20 4,00bc 20 8,47b 11,23ab 9 1,2 x 109 4 4,20 4,10ab 20 8,53ab 9,07bc 10 1,5 x 109 2 4,20 4,00bc 20 8,40b 10,63abc 11 1,5 x 109 3 4,20 4,00bc 20 8,40b 9,32bc 12 1,5 x 109 4 4,20 4,07ab 20 8,40b 10,69abc CV (%) 1,93 1,42 10,90 Ghi chú:
Các giá trị trong bảng là giá trị của 3 lần lặp lại. Trong cùng một cột các giá trị có mẫu tự giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%.
Độ Brix sau lên men của nghiệm thức 6 (mật số tế bào nấm men 9 x 108 tế bào/g và lên men 4 ngày) giảm mạnh (từ 20 xuống còn 8,4) và khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% so với các nghiệm thức còn lại (trừ nghiệm thức 1).
Độ pH sau lên men của nghiệm thức 6 (mật số tế bào nấm men 9 x 108 tế bào/g và lên men 4 ngày) giảm so với ban đầu và khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% với các nghiệm thức còn lại (trừ nghiệm thức 1 và 4).
Tóm lại, sử dụng lượng bột men vừa phải cùng thời gian lên men không quá dài nhưng hàm lượng ethanol đạt được khá cao. Vì vậy, nghiệm thức 6 sử dụng tỷ lệ bột men 0,75% với mật số 9x 108 tế bào/g cùng 4 ngày lên men là thích hợp cho quá trình lên men rượu.
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
- Phân lập được 27 dòng nấm men: AG1, AG2, AG3; BD1, BD2; CP1, CP2, CP3; TNL1, TNL2; TNN1, TNN2, TNN3; TS1, TS2; TO1, TO2; ST1, ST2; HG1, HG2, HG3; NK1, NK2, NK3; ĐT1, ĐT2 từ 10 loại men cơm rượu trên thị trường.
- Tuyển chọn được dòng nấm men TNL2 có hoạt lực lên men mạnh (làm đầy cột khí Durham (3cm) trong thời gian ngắn (10 giờ) và cho độ rượu sau lên men trên môi trường MF7 là 7,81 %v/v) thích hợp cho sản xuất bột men.
- Thử nghiệm sản xuất bột men với mật số cao 8,74 log CFU/gck.
- Tỷ lệ bột men sử dụng là 0,75% với mật số tổng số tế bào nấm men 9 x 108 tế bào/gck và sau 4 ngày lên men rượu cho hàm lượng cồn cao (11,66 %v/v).
5.2. Đề nghị
- Nghiên cứu các điều kiện bảo quản tồn trữ sản phẩm bột men. - Định danh các loài nấm men đã phân lập.
- Nghiên cứu các dòng nấm men đã phân lập có khả nằng chịu cồn, chịu nhiệt cao...nhằm bảo tổn các nguồn gen quý từ các sản phẩm truyền thống.
- Quy trình đề nghị sản xuất bột men cơm rượu thuần đã được đạt mật số nấm men cao 8,74 log CFU/gck.
Quy trình đề nghị:
Hình 10. Quy trình đề nghị sản xuất bột men cơm rượu ở quy mô phòng thí nghiệm
Ủ ở 30oC trong 3 ngày Sấy 1000C, 17 giờ
Để nguội 35 – 40oC
Chủng men giống 80% Bột gạo + 20% bột bắp
Xay thành bột, rây qua lưới có đường kính 0,5 cm Sấy ở 42oC/24 giờ
Bột men thuần
Nấm men thuần được chọn từ thí nghiệm 2
Ủ lắc 150 v/p, 30oC/24 giờ Môi trường PG
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Bùi Ái (2005), Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, NXB Đại học quốc
gia Tp. Hồ Chí Minh.
Đinh Thị Kim Lan (2011), Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên ứng dụng lên men rượu vang dứa Queen, Luận văn thạc sĩ ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đỗ Thị Yến Phương (2012), Phân lập và tuyển chọn nấm men Saccharomyces SP. trong cơm mẻ
để làm men bánh mì, Luận văn đại học ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần
Thơ.
Đoàn Thị Minh Nguyệt (2008), Tồn trữ và sử dụng nấm mốc, nấm men thuần trong lên men rượu từ gạo và nếp, Luận văn thạc sĩ ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Dương Thanh Vân (2012), Phân lập và tuyển chọn nấm men Saccharomyces cerevisiae trong cơm mẻ, cơm rượu để làm men bánh mì, Luận văn thạc sĩ ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Kim Ngọc Tuấn, Cách làm men và rượu các loại, NXB Đồng Tháp, 1997.
Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp. Nhà xuất bản Xây Dựng Hà Nội.
Lương Đức Phẩm (2006), Nấm men công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh.
Ngô Thị Phương Dung (2010), Nghiên cứu cải tiến qui trình sản xuất rượu lên men ở vùng Đồng bằng song Cửu Long, Đề tài khoa học và công nghệ cấp bộ.
Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng (2005), Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic, NXB Khoa học & Kỹ thuật Hà Nội.
Nguyễn Đức Lượng (1996), Cơ sở vi sinh vật công nghiệp, tập 1. Nhà xuất bản Đại Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh.
Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ Vi sinh, tập 3. Thực phẩm lên men truyền thống. NXB Đại học Quốc gia, TP. Hồ Chí Minh.
Nguyễn Huỳnh Bích Liễu (2010), Phân lập và tuyển chọn giống vi sinh vật lên men rượu nếp,
Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Võ Thị Thanh Trang (2012), Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên lên men rượu vang táo, Luận văn đại học ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Tiếng Anh
Berry D.R. (1995), Alcoholic beverage fermentation, In: Lea, A.G. and Piggott, J.R Edicr,
Fermented beverrge production, chapman & Hall Press London.
Holzapel, W, 1997, Use of starter cultures in fermentation on a household scale.
Lee, A.C. and Y. Fujio (1998), Microflora of banh men, a fermentation starter from Vietnam. World Journal of Microbiology and Biotechnology 15, pp. 51-55
Nout, M.J.R. (1995), Useful role of fungi in food processing, pp295-303. Introduction to Food- born Fungi. Fourth Edition.
Walker, G.M. (1998), Yeast Physiology and biotechnology, John Wiley & sons, Chichester.
Trang Web http://www.sinhk33.com/2013/01/cau-tao-nam-men.html (ngày 29/07/2013) http://ucchau.ndclnh.com/index.php?option=com_content&view=article&id=1811:t-cm-ru-ru- np-n-amazake&catid=17:bien-kho&Itemid=36 (ngày 30/07/2013) http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-khao-sat-toc-do-phat-trien-cua-nam-men-do-con-tao-thanh- cung-su-thay-doi-ph-cua-dich-qua-nho-theo-thoi-gian-khi-11143/ (ngày 01/08/2013) http://biopost.blogspot.com/ (ngày 02/08/2013) http://technologyinscience.blogspot.com/2011/11/cfu-colony-forming-unit- calculation.html#.UpIvH1tX2X8 (ngày 20/11/2013)
Hình 11. Một số loại men cơm rượu trên thị trường PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM
1.2. MỘT SỐ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM
Hình 12. Nồi khử trùng Hình 13. Kính hiển vi quang học
Hình 14. Thiết bị chưng cất rượu Hình 15. Cân điện tử
Hình 19. Khảo sát hoạt tính nấm men trên môi trường MF7 của dòng TNL2 1.3. HÌNH ẢNH CÁC THÍ NGHIỆM
Hình 18. Đo cột khí trong ống Durham (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 21. Thử hoạt tính bột men trong dịch rỉ đường
Hình 20. Bột men được sản xuất từ dòng TNL2
PHỤ LỤC 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.1. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM MEN:
Môi trường PGA bổ sung khoáng: (khoai tây 20% - Glucose 2% - Agar 2% - (NH4)2SO4
0,2% - KH2PO4 0,1%, nước cất vừa đủ 100%). Môi trường được pha chế bằng cách cắt 200g khoai tây đã gọt vỏ thành lát mỏng, đun sôi khoảng 20 phút trong nửa lít nước cất. Thêm 20g glucose, 20g agar, 2g (NH4)2SO4, 1g KH2PO4 và nước vừa đúng 1 lít, khuấy cho agar tan ra, khử trùng nhiệt ướt 121oC trong 15 phút, song song đó cũng tiến hành khử trùng đĩa petri. Sau khi khử trùng để nguội môi trường khoảng 45oC cho vào đĩa petri thành lớp dày khoảng 1cm, để nguội cho agar đặc lại. (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2004)
2.2. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ẨM ĐỘ Nguyên tắc
Theo chương trình sấy đến trọng lượng không đổi. Mẫu được nghiền mịn và sấy khô trong tủ sấy đã đạt nhiệt độ tiêu chuẩn. Độ ẩm được tính từ khối lượng mất đi trong quá trình sấy. Dụng cụ Tủ sấy 105oC Đĩa petri Bình hút ẩm Cân phân tích độ chính xác 0,001g Tiến hành
Cân khoảng 5 g mẫu đã nghiền nhỏ trong đĩa petri đã biết trọng lượng và đặt vào tủ sấy ở nhiệt độ 105oC, sau 24 giờ sấy làm nguội trong bình hút ẩm trong 10 phút, sau đó cân lại, ghi nhận kết quả. Sấy tiếp 24 giờ, sau đó làm nguội và cân lại lần 2 nếu khối lượng của 2 lần cân như nhau thì chỉ cần 24 giờ là đủ và xem như quá trình tách nước kết thúc.
Kết quả
Độ ẩm (w%) của mẫu được tính theo công thức W= (m1 – m2)/m1 x 100%
m1: khối lượng mẫu trước khi sấy (g) m2: khối lượng mẫu sau khi sấy (g)
2.3. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP SỐ LƯỢNG TẾ BÀO NẤM MEN BẰNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU
Nguyên tắc
Có thể sử dụng buồng đếm hồng cầu để xác định số lượng vi sinh vật có kích thước tế bào lớn như nấm men, bào tử nấm mốc, các loại tảo có trong mẫu dưới kính hiển vi có độ phóng đại X100 đến X400. Phương pháp đếm trực tiếp còn giúp quan sát được hình thái tế bào. Hình thái tế bào không bình thường giúp nhận biết tế bào không phát triển trong điều kiện tối ưu hoặc tế bào bị thay đổi kiểu gen hay kiểu hình.
Buồng đếm hồng cầu là một phiến kính dầy hình chữ nhật, giữa có phần lõm phẳng, tại đây có kẻ một lưới gồm 400 hình ô vuông nhỏ có diện tích tổng cộng 1mm2. Ô trung tâm có 25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn gồm có 16 ô vuông nhỏ. Thể tích diện tích một hình vuông nhỏ là 1/400 mm2 và một hình vuông lớn là 1/25 mm2.
Tiến hành
Khuấy đều dịch huyền phù tế bào, nhỏ một giọt lên buồng đếm kề với cạnh của lá kính nhờ một pipet. Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi có vùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được điền bởi dịch huyền phù tế bào, còn các rảnh xung quanh thì không bị ướt.
Di chuyển nhẹ nhàng buồng đếm để dịch huyền phù di chuyển nhẹ nhàng vào trong khoang có chiều dày khoảng 0,1 mm. Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi. Điều chỉnh cường độ ánh sáng để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn đường kẻ. Tùy thuộc vào số lượng tế bào mà có thể chọn cách đếm, tất cả tế bào có trong một ô trung tâm hay chỉ đếm các tế bào trong một số các ô vuông lớn đại diện. Phải đếm các tế bào nằm trên đường kẻ nhưng không lặp lại khi đếm tế bào ở ô kế cận.
Cách tính
Thể tích dịch chứa trên một ô trung tâm (gồm 25 ô vuông lớn hay 400 ô vuông nhỏ) là 1x0,1 = 0,1 mm3 (vì diện tích tổng cộng của các ô trung tâm là 1 mm2).
Tuy nhiên, chỉ cần đếm số tế bào trên 5 ô lớn đại diện cho 25 ô vuông lớn trên ô trung tâm. Khi đó, số lượng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu được tính bằng công thức sau.
n x x x b a N 10 10 1 , 0 400 3
Trong đó
N: số lượng tế bào trong 1 ml nghiên cứu.
a: số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ).
b: số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn (16x5=80 ô vuông nhỏ). 400: tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm.
0,1: thể tích dịch chứa tế bào trên ô trung tâm. 103: số chuyển mm3 thành ml.
10n: độ pha loãng mẫu
2.4. XÁC ĐỘ RƯỢU BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2000) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cho 100ml dung dịch sau khi lên men vào bình cầu của hệ thống chưng cất cồn, tiến hành chưng cất và thu lấy 100ml, chú ý đừng để cồn bay hơi.
Sau khi để dịch cất ổn định nhiệt độ, cho dịch cất vào ống đong có đường kính to gấp 2 lần đường kính nơi to nhất của cồn kế. Thả rượu kế vào và đọc độ rượu (dùng rượu kế: 0 – 30oC) và nhiệt độ sau đó quy về nồng độ rượu ở nhiệt độ chuẩn 20oC.
* Cách tiến hành:
Rửa sạch rượu kế và để khô
Đổ dịch định đo vào gần đầy ống đong
Thả từ từ rượu kế vào ống đong và để yên cho rượu kế ổn định vị trí đứng yên cân bằng
Quan sát sự tiếp xúc giữa rượu kế và bề mặt dung dịch rồi đọc số đo trên rượu kế, lấy rượu kế ra Lấy nhiệt kế và đo nhiệt độ của dung dịch
Tra bảng nhiệt độ và độ rượu tương ứng để biết được nồng độ ethanol của dung dịch ở điều kiện tiêu chuẩn.
2.5. PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHỈNH ĐỘ BRIX
Để có được độ Brix mong muốn, áp dụng công thức xác định độ khô cần cho dịch quả lên men bổ sung đường:
100 100 b a x x
Trong đó:
a: độ Brix ban đầu b: độ Brix cần đạt
x: lường đường bổ sung cho 100g dịch quả md: khối lượng dịch quả ban đầu
Sau khi thêm đường, dùng đũa thủy tinh khuấy từ từ cho đường tan hoàn toàn, kiểm tra lại độ Brix bằng Brix kế cầm tay.
2.6. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐNG TRÊN MÔI TRƯỜNG OGYA
Chuẩn bị đĩa petri vô trùng, môi trường Oxytetracyline Glucose Yeast Extract Agar được chuẩn bị hấp khử trùng và đỗ ra đĩa trước 1 - 2 ngày để khô bề mặt.
Phương pháp:
Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu: dung dich pha loãng mẫu là dung dịch nước muối sinh lý 0,85% đã khử trùng.
Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu: + Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng:
1g mẫu + 9ml dung dịch pha loãng => độ pha loãng 10-1