Nhóm 4. Nhóm tế bào hình oval to
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men trong các loại viên men cơm rượu
Qua quá trình phân lập từ 10 loại men cơm rượu trên thị trường, phân lập được 27 dòng nấm men được kí hiệu: AG1, AG2, AG3; BD1, BD2; CP1, CP2, CP3; TNL1, TNL2; TNN1, TNN2, TNN3; TS1, TS2; TO1, TO2; ST1, ST2; HG1, HG2, HG3; NK1, NK2, NK3; ĐT1, ĐT2.
Mô tả sơ bộ các dòng nấm men (phụ lục 3)
Dựa vào đặc điểm của 27 dòng nấm men đã phân lập có thể xếp thành 5 nhóm hình dạng đặc trưng (Hình 9).
Hình 9. Hình dạng 5 nhóm nấm men
Nhóm 1 – tế bào nấm men hình cầu nhỏ có 10 dòng: AG2, BD2, CP1, TNL1, TNL2, TNN2, TS1, TO1, ST1, NK3
Nhóm 2 – tế bào nấm men hình cầu to có 12 dòng: BD1, CP2, CP3, TNN1, TNN3, ST2, HG1, HG3, NK1, NK2, DDT1, ĐT2
Nhóm 3 – tế bào nấm men hình oval nhỏ có 1 dòng: AG1 Nhóm 1. Nhóm tế bào hình cầu nhỏ Nhóm 2. Nhóm tế bào hình cầu to Nhóm 3. Nhóm tế bào hình oval nhỏ Nhóm 5. Nhóm tế bào hình elip
Nhóm 4 tế bào hình oval to có 3 dòng: TS2, TO1, HG2 Nhóm 5 – tế bào hình elip có 1 dòng: AG3
4.2. Thí nghiệm 2:Tuyển chọn nấm men phân lập có hoạt tính cao
- So sánh khả năng khả năng lên men của dòng nấm men phân lập bằng phương pháp chuông Durham
Chiều cao cột khí CO2 thể hiện khả năng lên men rượu của các dòng nấm men. Tại các thời điểm đo khác nhau, chiều cao cột khí CO2 trong ống Durham cũng khác nhau cho thấy cường độ lên men của các dòng nấm men cũng khác nhau. Ở thời điểm 6 giờ đầu lên men, hầu như các dòng nấm men lên men rất yếu. Trừ dòng nấm men BĐ2, TNL2, NK2, ĐT1 có chiều cao cột khí sinh ra cao hơn các dòng còn lại, cho thấy các dòng này có khả năng lên men nhanh. Sau 20 giờ lên men, chiều cao cột khí trong ống Durham ít thay đổi do quá trình lên men đã kết thúc. Kết quả chiều cao cột khí CO2 sau 20 giờ lên men, các dòng nấm men AG2, BĐ2, CP2, CP3, TNL2, TNN1, TNN2, TS1, ST1, HG2, HG3, NK1, NK2, ĐT1, ĐT2 chiều cao cột khí trong ống Durham đạt tối đa (3,00 cm). Trong các dòng nấm men trên thì dòng nấm men TNL2 có thời gian lên men lên men ngắn (10 giờ) và chiều cao cột khí sinh ra trong ống Durham đạt tối đa (3,00 cm) (Bảng 2).
Bảng 2. Chiều cao cột khí CO2 (cm) trong ống Durham của 27 dòng nấm men đã phân lập
Chiều cao cột khí CO2 trong ống Durham (cm)
Dòng
nấm men 6 giờ 8 giờ 10 giờ 12 giờ 14 giờ 16 giờ 18 giờ 20 giờ
AG1 - 0,17 0,25 0,32 0,40 0,50 0,65 0,75 AG2 0,60 1,07 2,50 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 AG3 0,03 0,13 0,19 0,57 0,62 0,75 0,87 1,00 BD1 - 0,06 0,18 0,27 0,47 0,60 0,80 1,20 BD2 0,80 1,92 0,28 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 CP1 0,03 0,10 0,47 1,97 2,50 3,00 3,00 3,00 CP2 0,17 0,37 0,65 1,35 1,67 2,66 3,00 3,00 CP3 0,03 0,17 0,38 0,80 1,23 1,72 2,00 3,00 TNL1 - 0,13 0,23 0,71 1,30 1,60 1,80 2,01 TNL2 1,00 2,60 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 TNN1 0,70 1,10 1,50 1,90 2,73 3,00 3,00 3,00 TNN2 0,27 0,60 1,33 2,07 3,00 3,00 3,00 3,00 TNN3 - 0.13 0,45 0,75 0,91 1,30 1,56 1,74 TS1 0,06 0,62 1,05 1,35 2,33 2,73 3,00 3,00 TS2 - 0,07 0,15 0,35 0,44 0,70 1,02 1,33 TO1 - 0,03 0,10 0,27 0,40 0,53 0,62 0,73 TO2 - 0,27 0,31 0,40 0,67 0,75 0,87 1,00 ST1 0,10 0.24 0,52 1,37 1,90 2,50 3,00 3,00 ST2 - 0,03 0,10 0,15 0,37 0,43 0,63 1,33 HG1 0,017 0,067 0,22 0,32 0,53 0,65 0,87 1,13 HG2 0,36 0,85 1,30 1,95 2,60 3,00 3,00 3,00 HG3 - 0,24 0,63 1,33 2,17 2,67 3,00 3,00 NK1 - 0,07 0,23 0,75 1,45 2,03 3,00 3,00 NK2 1,20 1,80 2,50 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 NK3 - 0,09 0,27 0,80 1,15 1,50 1,73 1,97 ĐT1 1,30 1,90 2,35 2,65 3,00 3,00 3,00 3,00 ĐT2 - 0,40 0,67 0,90 1,40 1,85 2,30 3,00 Ghi chú:
(-) chưa có khí CO2 sinh ra. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình 3 lần lặp lại
- So sánh khả năng lên men của dòng nấm men trên môi trường MF7(so sánh độ Brix, pH, độ rượu sau quá trình lên men)
Bảng 3. Khả năng lên men của 27 dòng nấm men đã phân lập trên môi trường MF7
pH Độ Brix
Dòng nấm
men Trước lên
men Sau lên men Trước lên men Sau lên men Độ rượu sau lên men ở 20oC (%v/v)
AG1 4,80 3,70efg 18,20 12,50efghi 3,76cdef
AG2 4,80 3,60g 18,20 11,70defg 4,58cdef
AG3 4,80 4,00abc 18,20 13,50hij 2,60ghi
BD1 4,80 3,75defg 18,20 14,40j 2,21ghi BD2 4,80 4,10a 18,20 11,97defg 5,01cd CP1 4,80 3,60g 18,20 11,60def 4,59cdef CP2 4,80 3,65fg 18,20 13,70ij 3,11efghi CP3 4,80 3,85cde 18,20 10,80cd 5,94bc TNL1 4,80 3,8def 18,20 13,60ij 2,74ghi TNL2 4,80 3,85cde 18,20 7,75a 7,81a TNN1 4,80 3,85bcd 18,20 13,15ghij 2,41ghi TNN2 4,80 3,90bcd 18,20 13,20ghij 3,16efghi
TNN3 4,80 3,90def 18,20 12,60fghi 3,58defghi
TS1 4,80 3,60g 18,20 14,13j 1,81i
TS2 4,80 3,60bcd 18,20 11,467def 3,15efghi
TO1 4,80 3,90def 18,20 16,00k 1,81i
TO2 4,80 3,80def 18,20 12,60fghi 3,16efghi
ST1 4,80 4,05ab 18,20 12,00defgh 2,75ghi
ST2 4,80 3,00efg 18,20 13,80ij 2,35ghi
HG1 4,80 3,60g 18,20 14,30j 2,08hi
HG2 4,80 3,80def 18,20 9,90bc 5,03cd
HG3 4,80 3,70efg 18,20 13,90ij 3,05fghi
NK1 4,80 3,70efg 18,20 12,95fghij 3,57defgh
NK2 4,80 3,85cde 18,20 8,65ab 6,91ab
NK3 4,80 3,60g 18,20 13,70ij 3,12efghi
ĐT1 4,80 3,65fg 18,20 11,00cde 4,73cde
ĐT2 4,80 3,80def 18,20 11,60def 4,62cdef
CV (%) 4,22 15,33 24,01
Ghi chú:
Các giá trị trong bảng là giá trị của 3 lần lặp lại. Trong cùng một cột các giá trị có mẫu tự giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%.
Kết quả thể hiện ở bảng trên cho thấy độ rượu ở 20oC của dòng TNL2 là cao nhất (7,81 %v/v) và kế tiếp là của dòng NK2 (6,91 %v/v). Nhưng chỉ có dòng TNL2 chỉ khác biệt có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% với các dòng còn lại (trừ NK2). Dòng NK2 thì khác biệt không có ý nghĩa với TNL2 và CP3.
Độ Brix của tất cả các dòng đều giảm sau quá trình lên men do nấm men chuyển đường thành rượu. Trong đó, có các dòng TNL2, NK2 đều có độ Brix giảm mạnh sau quá trình lên men và chỉ có dòng TNL2 khác biệt có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% với các dòng còn lại (trừ NK2). Dòng NK2 khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% với dòng TNL2, HG2. Độ Brix sau khi lên men cao thì hàm lượng ethanol trong dịch lên men thấp và ngược lại.
Sau quá trình lên men giá trị pH rượu của 27 dòng nấm men đều giảm so với pH 4,80 của dịch lên men ban đầu. Hiện tượng pH giảm do hoạt động của nấm men trong quá trình lên men kị khí sinh ra CO2 và một số acid hữu cơ cũng làm giảm pH của dịch lên men.
Qua 5 ngày lên men, nhận thấy có 2 dòng TNL2 và NK2 là lên men tốt, sinh ra độ rượu cao hơn các dòng khác. Tuy nhiên, để chọn dòng có hoạt tính lên men cao nhất thích hợp để làm thí nghiệm 3 thử nghiệm sản xuất bột men thì chọn dòng TNL2.
4.3. Thử nghiệm sản xuất bột men
Dòng tế bào hoạt tính cao TNL2 được tuyển chọn để nuôi tăng sinh khối nhằm sản xuất bột men. Môi trường sử dụng để nuôi tăng sinh khối nấm men là PG (Potato Glucose). Sau 24 giờ ử trên máy lắc 150vòng/phút, chủng 120ml dung dịch huyền phù nấm men trong bình tam giác (mật số 107) vào bột gạo + bắp đã sấy ở 100oC trong 17 giờ.
Mật số tế bào nấm men trong bột men được xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu.
Bột men sau khi được sản xuất, pha loãng ở nồng độ 10-6, trải 100l dung dịch lên đĩa petri có môi trường OGYA đã được chuẩn bị trước, sau đó ủ 24 – 48 giờ ở 30oC và tổng số khuẩn lạc phát triển trên môi trường.
Kết quả sản xuất thử nghiệm được bột men từ dòng TNL2 có mật số tế bào nấm men là 8,74 log CFU/gck và độ ẩm của bột là 6,67%.
Mật số tế bào nấm men trong bột men 8,74 log CFU/g so với mật số nấm men trong một số viên men trên thị trường từ 7,49 – 10,23 log CFU/g (Ngô Thị Phương Dung, 2010) thì mật số nấm men trong bột men đã sản xuất là khá cao, phù hợp cho việc sử dụng để khảo sát tỷ lệ bột men và thời gian lên men.
4.4. Thử hoạt tính bột men
Trong quá trình lên men thì thời gian lên men là yếu tố quan trọng góp phần vào sự thành công của quá trình lên men rượu. Tuy nhiên, cũng cần xác định tỷ lệ bột men và thời gian thích hợp nhất để cho kết quả lên men tốt, mang lại hiệu quả cao. Ở đây ta bố trí từng tỷ lệ bột men với thời gian lên men khác nhau. Ở 3 nghiệm thức đầu tiên sử dụng 0,5% bột men với mật số là 6 x 108 tế bào/g. Nghiệm thức thứ 4, 5, 6 sử dụng 0,75% bột men với mật số là 9 x 108 tế bào/g. Nghiệm thức thứ 7, 8, 9 sử dụng 1% bột men với mật số là 1,2 x 109 tế bào/g. 3 nghiệm cuối cùng sử dụng 1,25% bột men với mật số là 1,5 x 109 tế bào/g. Quan sát các chỉ tiêu: pH sau lên men, Brix sau lên men, độ rượu ở 200C sau 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày.
Kết quả ở Bảng 5 cho thấy hàm lượng ethanol trong dịch đường hóa sau lên men của nghiệm thức 6 (mật số tế bào nấm men 9 x 108 tế bào/g và lên men 4 ngày) là cao nhất (11,66 %v/v). Nghiệm thứ 6 khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% với các nghiệm thức 1, 2, 3, 5, 8, 10, 12; tuy nhiên 7 nghiệm thức vừa nêu lại khác biệt không có ý nghĩa với nghiệm thức 4, 7, 9, 11 về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%.
So sánh kết quả lên men rượu của nghiệm thức 6 với khả năng lên men rượu (bột men Y3NT) của Hà Phương Thảo (2013) là cao hơn (11,66 %v/v so với 10,80 %v/v). Tuy mật số tế bào nấm men sử dụng ít hơn so với Hà Phương Thảo (9 x 108 tế bào/g < 3,7 x 109 tế bào/g) và thời gian lên men ngắn hơn (4 ngày < 5 ngày) nhưng độ rượu cao hơn điều đó cho thấy rằng, mật số nấm men quá cao và thời gian lên men dài sẽ làm ảnh hưởng đến khả năng lên men của nấm men. Bên cạnh đó độ pH cũng ảnh hưởng đến kết quả lên men, độ pH ở nghiệm thức 6 sau lên men là 4,10 nằm trong khoảng thích hợp cho lên men rượu 3,8 – 4,2 (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005) còn pH sau lên men rượu của bột men Y3NT là khá thấp chỉ còn 3,51.
Bảng 4. Khả năng lên men của từng tỷ lệ bột men qua các thời gian lên men khác nhau
pH Brix Nghiệm thức Mật số tế bào nấm men Số ngày lên men Trước lên men Sau lên men Trước lên men Sau lên men Độ rượu sau lên men ở 20oC (%v/v) 1 6 x 108 2 4,20 3,90c 20 8,70a 10,36abc 2 6 x 108 3 4,20 4,00bc 20 8,47b 10,20abc 3 6 x 108 4 4,20 4,13a 20 8,60ab 11,14ab 4 9 x 108 2 4,20 3,90c 20 8,40b 8,60c 5 9 x 108 3 4,20 4,00bc 20 8,60ab 10,57abc 6 9 x 108 4 4,20 4,10ab 20 8,40b 11,66a 7 1,2 x 109 2 4,20 4,00bc 20 8,60ab 9,16bc 8 1,2 x 109 3 4,20 4,00bc 20 8,47b 11,23ab 9 1,2 x 109 4 4,20 4,10ab 20 8,53ab 9,07bc 10 1,5 x 109 2 4,20 4,00bc 20 8,40b 10,63abc 11 1,5 x 109 3 4,20 4,00bc 20 8,40b 9,32bc 12 1,5 x 109 4 4,20 4,07ab 20 8,40b 10,69abc CV (%) 1,93 1,42 10,90 Ghi chú:
Các giá trị trong bảng là giá trị của 3 lần lặp lại. Trong cùng một cột các giá trị có mẫu tự giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%.
Độ Brix sau lên men của nghiệm thức 6 (mật số tế bào nấm men 9 x 108 tế bào/g và lên men 4 ngày) giảm mạnh (từ 20 xuống còn 8,4) và khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% so với các nghiệm thức còn lại (trừ nghiệm thức 1).
Độ pH sau lên men của nghiệm thức 6 (mật số tế bào nấm men 9 x 108 tế bào/g và lên men 4 ngày) giảm so với ban đầu và khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% với các nghiệm thức còn lại (trừ nghiệm thức 1 và 4).
Tóm lại, sử dụng lượng bột men vừa phải cùng thời gian lên men không quá dài nhưng hàm lượng ethanol đạt được khá cao. Vì vậy, nghiệm thức 6 sử dụng tỷ lệ bột men 0,75% với mật số 9x 108 tế bào/g cùng 4 ngày lên men là thích hợp cho quá trình lên men rượu.
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
- Phân lập được 27 dòng nấm men: AG1, AG2, AG3; BD1, BD2; CP1, CP2, CP3; TNL1, TNL2; TNN1, TNN2, TNN3; TS1, TS2; TO1, TO2; ST1, ST2; HG1, HG2, HG3; NK1, NK2, NK3; ĐT1, ĐT2 từ 10 loại men cơm rượu trên thị trường.
- Tuyển chọn được dòng nấm men TNL2 có hoạt lực lên men mạnh (làm đầy cột khí Durham (3cm) trong thời gian ngắn (10 giờ) và cho độ rượu sau lên men trên môi trường MF7 là 7,81 %v/v) thích hợp cho sản xuất bột men.
- Thử nghiệm sản xuất bột men với mật số cao 8,74 log CFU/gck.
- Tỷ lệ bột men sử dụng là 0,75% với mật số tổng số tế bào nấm men 9 x 108 tế bào/gck và sau 4 ngày lên men rượu cho hàm lượng cồn cao (11,66 %v/v).
5.2. Đề nghị
- Nghiên cứu các điều kiện bảo quản tồn trữ sản phẩm bột men. - Định danh các loài nấm men đã phân lập.
- Nghiên cứu các dòng nấm men đã phân lập có khả nằng chịu cồn, chịu nhiệt cao...nhằm bảo tổn các nguồn gen quý từ các sản phẩm truyền thống.
- Quy trình đề nghị sản xuất bột men cơm rượu thuần đã được đạt mật số nấm men cao 8,74 log CFU/gck.
Quy trình đề nghị:
Hình 10. Quy trình đề nghị sản xuất bột men cơm rượu ở quy mô phòng thí nghiệm
Ủ ở 30oC trong 3 ngày Sấy 1000C, 17 giờ
Để nguội 35 – 40oC
Chủng men giống 80% Bột gạo + 20% bột bắp
Xay thành bột, rây qua lưới có đường kính 0,5 cm Sấy ở 42oC/24 giờ
Bột men thuần
Nấm men thuần được chọn từ thí nghiệm 2
Ủ lắc 150 v/p, 30oC/24 giờ Môi trường PG
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Bùi Ái (2005), Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, NXB Đại học quốc
gia Tp. Hồ Chí Minh.
Đinh Thị Kim Lan (2011), Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên ứng dụng lên men rượu vang dứa Queen, Luận văn thạc sĩ ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Đỗ Thị Yến Phương (2012), Phân lập và tuyển chọn nấm men Saccharomyces SP. trong cơm mẻ
để làm men bánh mì, Luận văn đại học ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần
Thơ.
Đoàn Thị Minh Nguyệt (2008), Tồn trữ và sử dụng nấm mốc, nấm men thuần trong lên men rượu từ gạo và nếp, Luận văn thạc sĩ ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Dương Thanh Vân (2012), Phân lập và tuyển chọn nấm men Saccharomyces cerevisiae trong cơm mẻ, cơm rượu để làm men bánh mì, Luận văn thạc sĩ ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Kim Ngọc Tuấn, Cách làm men và rượu các loại, NXB Đồng Tháp, 1997.
Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp. Nhà xuất bản Xây Dựng Hà Nội.
Lương Đức Phẩm (2006), Nấm men công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh.
Ngô Thị Phương Dung (2010), Nghiên cứu cải tiến qui trình sản xuất rượu lên men ở vùng Đồng bằng song Cửu Long, Đề tài khoa học và công nghệ cấp bộ.
Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng (2005), Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic,